Nature | 突破序列限制：利用DNA三向连接实现通用自组装，构建复杂DNA序列

撰文 | Enigma

随着DNA测序和编辑技术（如长读长测序和CRISPR-Cas系统）的飞速发展，从头合成（de novo）长片段、复杂且多样化的DNA序列的能力却严重滞后，成为工程化研究和理解生物学的关键瓶颈。当前所有DNA组装技术（如聚合酶循环组装（PCA）、Gibson组装、Golden Gate组装等）都依赖于最终构建序列本身所含的信息（如互补的单链粘末端overhangs）来指导片段连接 ， 导致用于指导组装的序列（粘末端）本身会成为最终序列的一部分，因此，无法在不改变最终产物序列的前提下，对这些引导序列进行独立、广泛的优化，以最大化组装效率和特异性。这种内在局限性导致了错误组装，从而限制了合成产物的效率、大小和复杂性。

为解决这一根本性难题，近 日， 加州理工学院 王开航 团队 在Nature期刊发表题为 Construction of complex and diverse DNA sequences using DNA three-way junctions 的研究论文，开发出名为 Sidewinder 的新型DNA组装技术，利用DNA三向连接（three-way junction, 3WJ）将组装指导信息与最终序列分离，实现了真正的序列无关性组装，为复杂 DNA 构建开辟了全新路径。

本研究的工作流程主要围绕Sidewinder技术的开发、验证、应用和性能评估展开，核心创新 在于 Sidewinder技术原理设计 。 与传统的双链连接（2WJ）不同，Sidewinder利用DNA三臂连接结构。每个组装片段由一条“条形码”寡核苷酸和一条“编码”寡核苷酸退火形成异源双链。片段末端包含两个关键部分：一是短的“立足点”序列（t/t*，类似传统粘末端），二是长的、唯一的“Sidewinder条形码”序列（b/b*）。关键突破在于，条形码序列仅用于指导组装，通过形成“侧向螺旋”（Sidewinder helix）将两个片段精确对齐，并促使互补但不稳定的立足点靠近、稳定，最终通过连接酶连接。连接后，侧向螺旋可以被移除，从而在最终序列中无痕恢复标准的双链连接。这实现了组装指令（条形码）与最终编码序列（立足点及其连接产物）的物理分离。

通过可行性验证后进行规模化组装，传统技术在5片段以上组装就易出现错配，而Sidewinder技术可轻松实现40个片段的一次性组装，构建 LuxABCDE 操纵子片段。纳米孔测序显示，96.72%的测序reads为目标产物，且 100% 的正确产物中片段顺序完全无误。连接点分析更是检测到22533个连接位点，无一错配，展现出极高的组装保真度。

为证明其序列无关性，作者选择了两个极具挑战性的序列：一是人载脂蛋白E（ApoE）的高GC含量（70%，局部达95%）编码序列，拆分为12个片段进行组装，纳米孔测序显示 99.89% 的产物为正确组装，50636 个连接位点全部无误。二是来自Glyphotaelius pellucidus丝蛋白H-Fibroin的高度重复序列片段。为了将挑战推到极限，构建高度重复的蚕丝蛋白h-fibroin片段，即使采用完全相同的toehold序列（传统技术无法实现），仍能实现5片段精准组装，正确组装率达99.19%。

进一步将编码不同颜色表型标记蛋白（mScarlet，mGl，aeBlue）的三个独立的十片段组装体系混合在同一个反应管中实现一锅法并行组装。Sidewinder技术可实现三者的独立精准组装。通过特异性引物扩增，每个基因均能得到单一目标条带，正确组装率均超过95%，转化后大肠杆菌克隆均呈现预期表型，为高通量基因合成提供了高效方案。

总而言之，本研究开发并验证了Sidewinder技术——一种基于DNA三向连接的革命性DNA组装技术。它从根本上解决了传统方法中组装指令与最终序列耦合的固有矛盾，实现了真正的序列无关组装。该技术能够以前所未有的保真度、规模和复杂度从头合成DNA，包括大规模多片段组装、高GC/高重复序列、并行多构建体组装以及高覆盖度的组合文库。

其科学价值在于为合成生物学和基因工程提供了一个全新的、功能强大的“写作”工具，极大地扩展了可合成DNA序列的设计空间。应用价值广泛，可应用于合成基因组学、人工智能辅助的蛋白质设计、新型生物材料开发、蛋白质定向进化以及需要高复杂度DNA构建体的基础研究等领域。Sidewinder技术有望弥合DNA“读”、“编”、“写”能力之间的差距，推动生物工程进入新阶段。

https://www.nature.com/articles/s41586-025-10006-0

制版人： 十一

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