Nature | piRNA通路的“无处可藏”机制：保障生殖细胞DNA甲基化完整性

撰文|亦

在哺乳动物生殖细胞发育过程中，其基因组会经历DNA甲基化的重编程与擦除，这虽然对细胞命运重置至关重要，却也解除了对转座子的抑制，使其可能通过“跳跃”破坏基因组完整性，威胁整个生殖细胞谱系的存续。为此，细胞进化出了PIWI互作RNA（piRNA）通路，在发育的关键窗口期提供“抗转座子免疫”【1-3】。该通路的核心在于引导DNA从头甲基化，从而长效沉默转座子。已知其起始步骤是支架蛋白SPOCD1被招募到活跃的LINE1转座子位点【4】，随后piRNA会引导PIWI蛋白MIWI2结合新生转座子RNA，并最终招募包括DNMT3C/DNMT3L在内的甲基化机器完成DNA甲基化【5-6】。然而，一个根本性问题始终未解： 细胞核内执行该任务的piRNA因子和甲基化机器主要存在于开放的“常染色质”区域，而紧密压缩的“组成型异染色质”区域对其而言如同“盲区”。那么，piRNA通路如何确保那些可能恰好位于或被动陷入异染色质“盲区”的活跃转座子也能被成功甲基化，而不至于成为逃逸监控的“免疫特权位点”？ 这正是本研究致力于解决的核心科学问题。

近日，来自爱丁堡大学再生医学中心的Dónal O’Carroll团队在Nature上发表了一篇题为A nowhere-to-hide mechanism ensures complete piRNA-directed DNA methylation的文章。 该研究揭示了一个由SPOCD1-TPR互作介导的核心机制：piRNA通路巧妙地“征用”了TPR的异染色质排除能力，强制性地将需要被沉默的基因组位点维持在开放的常染色质状态，从而保证了piRNA导向的DNA甲基化能够高效、完全且非随机地覆盖所有目标，实现了真正的“无处可藏”。

研究团队通过免疫荧光染色系统性地观察了E16.5胎儿生殖细胞中piRNA通路核心因子（SPOCD1、MIWI2、DNMT3L、DNMT3C、C19ORF84和SPIN1）的核内定位。他们发现 所有这些因子均显著富集于活跃转录标志物H3K4me3所在的常染色质区域，而被排除在由HP1B或H3K9me3标记的结构性异染色质之外。这一模式在piRNA引导的DNA甲基化起始和持续期间稳定存在 。这一发现揭示了一个根本性的防御漏洞：由于piRNA机器无法有效进入异染色质，任何因基因组位置偶然被纳入异染色质环境的活跃转座子（如LINE1），都将成为“免疫盲区”并逃脱DNA甲基化，从而对生殖细胞基因组的长期稳定性构成潜在威胁 。

为探究如何清除基因组中的“免疫特权位点”，作者 假设存在主动机制，并聚焦于直接结合活性LINE1位点的支架蛋白SPOCD1 。通过免疫沉淀-质谱分析E16.5胎儿睾丸组织，他们发现SPOCD1与核孔篮状结构成分TPR特异性结合。进一步的生化与结构生物学分析揭示，SPOCD1的TFIISM结构域通过其表面一个保守的带正电斑块（关键残基K464）与TPR中部的特定区域（775-877 aa，含关键残基E830/E832）直接发生静电相互作用。TPR在正在进行DNA甲基化的胎儿生殖细胞中表达量异常高，且弥漫分布于核质。

为验证该互作的生理功能，作者利用CRISPR-Cas9构建了携带SPOCD1-K464A点突变的小鼠（ Spocd1 K464A ）。该突变特异性破坏与TPR的结合，而不影响蛋白表达。突变体雄性小鼠完全不育，睾丸发育异常，生精过程阻滞。DNA甲基化组分析显示，突变体生殖细胞中，年轻的LINE1家族（如L1Md_A, T, Gf）启动子区出现显著的DNA低甲基化，而古老的LINE1或IAP元件甲基化水平接近野生型。值得注意的是，与SPOCD1完全敲除或MIWI2、C19orf84敲除相比，K464A突变导致的甲基化缺陷程度更轻且呈现更高的随机性，提示 SPOCD1-TPR互作保障的是一种高保真、非随机性的甲基化过程 。

那么，破坏SPOCD1-TPR互作如何导致年轻LINE1甲基化出现随机性缺陷呢？细胞学分析给出了答案：在 Spocd1 K464A 突变体的胎儿生殖细胞中，相当一部分SPOCD1蛋白，连同其互作伙伴SPIN1和C19ORF84，错误地定位并聚集在由HP1B标记的异染色质区域。然而，介导piRNA靶向的MIWI2和执行甲基化的DNMT3L/C却并未被招募至这些异染色质灶。这意味着， 一旦SPOCD1失去TPR的“锚定”，它及其结合的染色质位点便有风险被“拖入”异染色质环境 。DNA-FISH与免疫荧光共标实验为此提供了直接证据：在突变体中，LINE1 DNA序列信号确实出现在这些异染色质灶内并与SPOCD1共定位；同时，piRNA通路的另一个靶标——印记基因 Rasgrf1 的位点，也显著更频繁地出现在异染色质区域。

因此，SPOCD1与TPR的相互作用构成了一个 “无处可藏”机制的核心。 TPR利用其固有的形成“异染色质排除区”的能力，在核内（包括核质）创建一个不利于异染色质形成的微环境。通过与TPR结合，SPOCD1能确保其自身以及它所识别的活跃LINE1和Rasgrf1等靶标位点，被主动维持在开放的、可访问的常染色质状态，从而无条件地暴露给巡逻的MIWI2-piRNA复合物及紧随其后的DNA甲基化机器，实现了对全基因组的无死角监视 。值得注意的是，该机制具有靶标特异性，主要保障LINE1和特定基因座的甲基化，而IAP等元件的沉默则通过其他路径实现。

综上所述，这项研究 发现piRNA通路通过一种主动的“无处可藏”机制来消除基因组盲区，确保对转座子的全覆盖监控，并首次将核孔成分TPR的功能与piRNA导向的DNA甲基化联系起来，扩展了对核结构与表观遗传调控关系的理解。 为研究生殖细胞基因组稳定性、表观遗传编程提供新视角，可能为相关生殖疾病提供潜在治疗靶点 。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-09940-w

制版人： 十一

参考文献

1. Aravin, A. A., Sachidanandam, R., Girard, A., Fejes-Toth, K. & Hannon, G. J. Developmentally regulated piRNA clusters implicate MILI in transposon control.Science316, 744–747 (2007).

2. Carmell, M. A. et al. MIWI2 is essential for spermatogenesis and repression of transposons in the mouse male germline.Dev. Cell12, 503–514 (2007).

3. Kuramochi-Miyagawa, S. et al. DNA methylation of retrotransposon genes is regulated by Piwi family members MILI and MIWI2 in murine fetal testes.Genes Dev.22, 908–917 (2008).

4. Dias Mirandela, M. et al. Two-factor authentication underpins the precision of the piRNA pathway.Nature634, 979–985 (2024).

5. De Fazio, S. et al. The endonuclease activity of Mili fuels piRNA amplification that silences LINE1 elements.Nature480, 259–263 (2011).

6. Schopp, T. et al. TEX15 is an essential executor of MIWI2-directed transposon DNA methylation and silencing.Nat. Commun.11, 3739 (2020) .

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