Cell Stem Cell | 构建更真实的“体外眼睛”：血管化视网膜类器官助力神经节细胞长期存活与功能重建

撰文|觉主在路上

视觉过程起源于眼球后部的视网膜组织，其中视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）是唯一的投射神经元，在处理视觉特征并将其传输至更高层大脑区域的过程中发挥着不可替代的作用【1】。由于获取人类视网膜活体标本受到极大限制且离体功能保存困难，视网膜类器官（retinal organoids,RO）技术的兴起为研究提供了组织来源，尤其是AMASS方法已能生成在结构和转录组水平上与成年视网膜高度相似的复杂组织【2】。然而，现有的RO模型仍存在一些功能瓶颈：类器官的功能成熟极其缓慢, 通常需20周以上才产生光敏性；位于类器官核心的RGCs在标准培养方法下会发生快速的早期退化和功能丧失，导致类器官缺乏长期的组织完整性。这种退化的根本诱因主要为两点：首先是物理几何限制导致RGC轴突在浮动的3D球体中缺乏有组织的向外生长路径，无法建立长程连接，从而诱发神经元凋亡；其次是由于缺乏血管系统支持，类器官内部存在严重的氧气与营养扩散障碍，导致深层组织长期处于严重的低氧状态【3,4】。因此，建立一个能缓解低氧并为轴突生长提供稳定微环境的体外模型是该领域迫切的需求。

近日，来自德国波恩大学的Volker Busskamp研究团队在Cell Stem Cell上发表了题为Retinal ganglion cell survival and functional maturation in transiently vascularized human retinal organoids的文章。团队引入了干细胞衍生的内皮细胞以诱导产生瞬时血管样网络，并利用定制的微流控设备来稳定轴突的生长，为RGCs提供稳定的生长微环境和物理投射路径。结果显示，血管化支持显著减轻了类器官核心的低氧压力并减少了细胞凋亡，使RGCs在第18周时的存活率由对照组的1.21%显著提升至18.2%，这表明 RGCs 的长期存活和发育成熟得到了显著改善。通过集成微电极阵列（MEAs）与光遗传学技术，观察到由光感受器驱动的ON、OFF和ON-OFF型功能性光反应环路，表明其具备了环路水平的视网膜活动。该研究为视网膜的基础研究和治疗创新提供了极具变革性的工具。

血管化类器官网络的建立

研究者利用 ETV2.2 转录因子对 hiPSCs 进行编程，诱导其分化为通用型内皮细胞，诱导效率极高，约 80% 的细胞表达 PECAM1+/EGFP+。为了确定最佳的自组织过程，研究确立了“C3”方案：在第3天预先接种内皮细胞形成单层，并在第7天将发育中的类器官胚体（embryoid body, EB）放置在该单层上，使其自然包裹并整合内皮细胞，在 第 28 天进行刮取，使类器官进入 3D 悬浮培养阶段。这种方法成功在类器官内部构建了动态重塑的血管样网络：在第4至10周呈现典型的管腔结构，随后在第18至22周转变为径向形态。通过荧光右旋糖酐灌注实验证实，约 41.3% 的 PECAM1+ 管腔具有与外部介质相通的开口，能够通过被动扩散输送营养。利用活体低氧试剂检测发现，血管化组（vascularized ROs, vROs）内部的低氧信号显著低于对照组，这种微环境的改善直接导致了组织凋亡的减少以及类器官体积的增大。最核心的验证在于 RGCs 的长期存活：在第18周，vROs 中 POU4F1+ RGCs 的占比高达 18.2%，而对照组仅残存 1.21%。此外，单细胞核转录组分析（snRNA-seq）显示，vROs 中的 RGCs 具有更高的发育成熟度得分（52% vs 36%），从分子水平证明了血管系统对神经发育的促进作用。

微流控轴突引导系统的建立

为了解决 RGC 轴突在 3D 浮动环境中因缺乏投射路径而退化的问题，研究者设计并制造了定制的 PDMS 微流控设备。该设备包含两个由 8 条微通道连接的独立腔室，微通道的高度被严格限制在 5 μm（宽度 30 μm，长度 1200 μm），这一尺寸起到了物理过滤作用，仅允许细长的 RGC 轴突穿过，而将神经元胞体留在原位腔室内。该设备被安装在微电极阵列（MEAs）芯片上，使电极精确分布在微通道下方，从而对轴突进行电生理记录。结果显示，将第15周的类器官放入设备后，RGC 轴突在 1 周内即可进入通道并抵达对侧。MEA 记录证实 vROs 表现出更高频率的自发动作电位。为了验证功能，研究人员还开发了由 RGC 特异性启动子 POU4F1 驱动的 f-ChRimson-EYFP 光遗传学表达系统结，该工具在感光细胞尚未发育成熟前，通过黄光特异性激活 RGCs，以验证该系统记录视网膜输出信号的能力。利用技术，研该技术，研究者能够在感光细胞成熟前通过黄光脉冲精准激活 RGCs，证明了系统捕获视网膜输出信号的可靠性。更重要的功能验证是在第31周，此时对照组已完全丧失活性，而 vROs 在微流控平台的支持下展示了由光感受器驱动的典型 ON、OFF 和 ON-OFF 型光反应。这表明该系统在体外首次实现了从光感受到 RGC 信号输出的垂直整合功能环路的长期维持。

模型模拟人类视网膜病理过程的验证

研究团队进一步探索了该血管化平台模拟人类疾病的能力。通过将第 12 周的 vROs 暴露于 4% O2（极低氧） 和 VEGF 因子 中，成功模拟了早产儿视网膜病变（retinopathy of prematurity, ROP）中的血管新生和病理重塑特征。在分子水平上，RT-qPCR 检测证实了促血管生成基因的上调，包括 PECAM1 和 vWF 的 mRNA 表达量显著升高。组织学验证发现 COL4A1+ 的基底膜结构在某些区域呈现“空套管”状，提示该模型捕捉到了血管新生与退行并存的复杂动态特征。这进一步更了该生物工程系统能够对环境提示作出稳健的生理与病理反应。

总的来说，该研究通过“血管化+微流控”双重方案解决了 RGC 退化的难题，并首次在体外证明了人类视网膜类器官可以建立起类似真实视网膜的、分工明确的（ON/OFF）垂直信号处理环路，这一生物工程平台为人类视网膜发育研究提供了一个高保真的长效体外模型。

https://doi.org/10.1016/j.stem.2025.12.013

制版人： 十一

参考文献

[1] Gollisch, T., and Meister, M. (2010). Eye smarter than scientists believed: neural computations incircuits of the retina.Neuron65, 150–164.

[2] Cowan, C.S., Renner, M., De Gennaro, M., Gross-Scherf, B., Goldblum, D., Hou, Y., Munz, M., Rodrigues, T.M., Krol, J., Szikra, T., et al. (2020). Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.Cell182, 1623–1640.e34.

[3] Monfort, T., Azzollini, S., Brogard, J., Cle ´menc¸on, M., Slembrouck-Brec, A., Forster, V., Picaud, S., Goureau, O., Reichman, S., Thouvenin, O., et al. (2023). Dynamic full-field optical coherence tomography module adapted to commercial microscopes allows longitudinal in vitro cell cul ture study.Commun.Biol. 6, 992.

[4] Singh,R.K., andNasonkin,I.O.(2020). Limitations andPromise ofRetinal Tissue From Human Pluripotent Stem Cells for Developing Therapies of Blindness.Front. Cell. Neurosci.14, 179.

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