Genome Med | 新计算工具METER同步实现ctDNA甲基化的灵敏检测、精确定量及肿瘤亚型分型

液体活检是癌症临床管理一项新利器。基于游离DNA（cfDNA）液体活检技术的核心应用策略在于检测患者血液样本cfDNA中循环肿瘤DNA（ctDNA）的存在比例，即肿瘤含量（TC）。TC已被证实是乳腺癌等多种癌症的独立预后生物标志物，同时也是治疗期间疾病监测的重要工具。目前，分析TC最常见且有效的策略之一是通过ichorCNA技术，对靶标序列或低通量全基因组测序（lpWGBS）结果中的拷贝数变异（CNA）及体细胞点突变进行分析。但lpWGBS检测ctDNA的典型下限约为3%，这限制了其在低ctDNA水平这种具有挑战性场景中的临床应用。

为此，意大利托斯卡纳大学研究团队开发了计算工具METER，利用肿瘤类型特异性DNA甲基化模式，对血浆样本低通量（0.5-1×）全甲基化组测序中的ctDNA进行灵敏检测、精确定量及肿瘤亚型分型。在转移性乳腺癌患者的纵向样本中，即使TC水平低于3%，METER仍提供了TC的精确定量和较高的灵敏度，显示出比当前最先进ctDNA检测方法及匹配的循环肿瘤细胞（CTC）计数更强的临床结局相关性，从而有效支持疾病监测和预后分层。METER还能准确推断肿瘤亚型，为循环肿瘤信号的全面分析提供了便利。同时，METER方法具有成本效益，因为在测序之前无需对特定区域进行富集，只需要少量（10-20纳克）的输入DNA。总之，METER（https://github.com/caos-lab-unifi/meter）将TC评估与亚型分型整合于单一框架中，为精准肿瘤学提供了灵敏且准确的分析手段。

METER方法及研究概述

研究团队希望开发一种实用且经济高效的ctDNA检测、定量和分子的分析策略，并有望在转移性疾病的常规临床应用中得到应用，包括早期治疗阶段。为此，研究团队对两个来自早期治疗的转移性乳腺癌患者队列进行了研究：MIMESIS-1（测试队列，包含30名健康捐赠者和59名转移性乳腺癌患者的154份血浆样本）和MIMESIS-2（验证队列，包含65名转移性乳腺癌患者的214份血浆样本），对所有血浆cfDNA样本均进行了lpWGBS（图1A）。

用于血浆低通量甲基化组分析的METER由三个模块组成：METER-quant，用于检测cfDNA中的TC；METER-detect，用于检测cfDNA中的ctDNA并将样本分类为ctDNA+/-；METER-subtype，用于从cfDNA中推断分子亚型。该流程利用了公共数据集的肿瘤特异性差异甲基化CpG位点（DMS）和差异甲基化CpG区域（DMR），在MIMESIS-1数据集上进行了开发和技术评估（图1B）。

研究团队将METER应用于上述124名早期一线治疗的转移性乳腺癌患者的338份血浆样本，以评估其性能。研究利用ichorCNA技术生成了参考性TC数值，并结合MIMESIS-1中的临床数据及CTC计数结果来评估METER预测结果的临床相关性。随后在MIMESIS-2数据集中对METER的可靠性进行验证，以确定其是否适合作为监测接受一线或二线治疗转移性乳腺癌患者的工具。

图1. mimesis-1与mimesis-2研究队列及研究概述。

METER-quant：精确定量TC

METER-quant模块旨在从血浆cfDNA低通量甲基化测序图谱中实现准确的TC量化，通过评估常见肿瘤类型特异性DMS的甲基化状态，并计算肿瘤样CpG位点的比例（pTS）来提供TC估计值（图2A）。在MIMESIS-1数据集的154份血浆样本中，METER-quant估算的124个转移性乳腺癌cfDNA样本的TC值与使用最先进的工具ichorCNA所获得的值高度一致（相关性 R>0.90）（图2B）。METER-quant对低TC值（在ichorCNA估算3%-10%范围内）的估计也十分准确且具有可比性。再进一步分析中，METER-quant能够精确地估计到0.5 - 1%范围，与预期值的相关性更高（R = 0.96），并且离散度更低（MAE = 0.005，RMSE = 0.006），优于 ichorCNA（图2C）。

图2.通过METER-quant对MIMESIS-1队列的cfDNA样本进行TC定量。

METER-detect：灵敏检测极低水平ctDNA

METER-detect旨在检测在低TC条件下的ctDNA，通过评估映射到DMR的reads甲基化状态，计算肿瘤样reads的比例（pTR），并根据对照组pTR的分布将样本分类为 ctDNA+/-（图3D）。研究团队将METER-detect应用于MIMESIS-1的对照和肿瘤cfDNA样本，并重点关注了60个未被 ichorCNA检测到的肿瘤样本。研究显示，METER-detect检测的pTR值在肿瘤样本和对照样本之间显著差异（图3E），具有更高的灵敏度和特异性。进一步计算机模拟评估显示，METER-detect对于TC为1%和0.5%的情况，敏感度分别为100%和60%，其敏感度可能会随着覆盖水平的提高而增加（图3G）。

图3.通过METER-detect对MIMESIS-1队列的cfDNA样本进行ctDNA检测。

METER-subtype：准确推断转移性乳腺癌患者血浆样本中ER状态

通过ctDNA分析无创评估乳腺癌患者的ER状态正日益成为一项重要临床需求。基于先前筛选的DMR，研究团队通过对比分析ER+/HER2-与ER-/HER2-乳腺癌的基线WGBS数据集，鉴定出一组具有ER状态信息的DMR。在METER-subtype模块中，利用这些亚型特异性DMR将cfDNA低通甲基化组的信号解卷积为ER+、ER-及正常cfDNA组分（图4A）。亚型DMR在ER+/HER2-和ER-/HER2-参考样本中的DNA甲基化中位水平表现出独特模式，证实了该分析的可靠性（图4B）。

研究对不同总胆固醇（TC）范围对应的样本集进行了ROC曲线分析。对TC值为METER-quant≥5%的样本，METER-subtype实现了较高的分类性能（AUC=0.98），对TC值低于这一阈值的样本，分类效果较差（AUC=0.56）。但即使在TC值较低的情况下，METER-subtype也有可能推断出ER状态，准确性有所降低，这在TC<5%的METER+样本中得到了证实（AUC=0.73）。（图4C）

研究人员比较了METER-subtype与cfDeconvolve及Griffin在TC≥5%样本（n = 44）中的性能表现。结果显示，METER-subtype的分类效果优于Griffin（AUC=0.79）和cfDeconvolve（AUC=0.93），且两者具有可比性（图4D）。在TC≥3%的样本中也获得了类似的比较结果。在44个METER-quant≥5%的样本中，METER-subtype的分类准确率为0.95。

图4.METER-subtype对MIMESIS-1队列cfDNA样本进行ER亚型分类。

METER在MIMESIS-2队列的验证

在独立的MIMESIS-2队列血浆样本中，METER-quant对214个cfDNA转移性乳腺癌样本的TC估值与ichorCNA之间具有极好的一致性，表明METER-quant能够提供精确的TC定量，并显示了预期的TC动态变化，证实了其在纵向疾病监测方面的可靠性。METER-detect在连续时间点提供的结果具有一致性。在48例METER-quant≥5%的样本中，METER-subtype的准确率为0.90，一致性比（CR）为0.85，与MIMESIS-1分析结果一致。

与ichorCNA相比，METER-detect在PFS和总生存期（OS）方面均显示出更高的检测灵敏度和更有效的预后分层，即使将分析限定于ichorCNA患者，且在调整临床相关协变量后，相关性仍保持显著。值得注意的是，METERdetect可作为比影像学检查更早提示疾病进展的工具。

图5.在MIMESIS-2数据集上对METER预测的验证。

此外，研究人员将METER在MIMESIS-1队列中获得的结果与相关患者的临床数据进行了对比分析，发现METER预测结果与相关的临床预后因素密切相关，治疗前基线时的METER-定量TC值与研究开始时的转移病灶数量之间存在正相关关系（图6A）。对于TC水平低于3%的患者，METER-detect能够进行相关的预后分层分析，表现优于ichorCNA；METER+患者的无进展生存期（PFS）明显更差。与CTC相比，METER的预后能力更优，进一步证实了METER预测的临床有效性。研究表明，METER与独立评估的CTC数据相结合，并提供了更完善的预后分层方案。

图6.METER预测结果与相关临床因素及MIMESIS-1队列中患者预后的关联。

结语

该研究开发的METER是一种简单、可靠且经济高效的，基于血浆低通量全甲基化组测序的全面ctDNA分析工具，能够提升在诸如转移性疾病监测（在一线或二线治疗期间）等具有挑战性的场景下的ctDNA分析效果。利用肿瘤类型特异性的甲基化信号，METER能够以精确的量化和灵敏的检测方式在复杂的低TC范围内对ctDNA 进行分析和肿瘤分型。此外，该方法可推广到其他肿瘤类型或亚型，通过肿瘤特异性的DMS和DMR实现，从而扩大其临床应用范围。

原文信息：

Paoli, M., Galardi, F., Nardone, A. et al. A computational framework for sensitive tumor detection and accurate subtyping using shallow cell-free DNA methylome sequencing. Genome Med (2026). https://doi.org/10.1186/s13073-026-01603-3

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