东南大学商珞然课题组《自然·通讯》：相分离构筑pH分区：液滴原始细胞模拟细胞器微环境调控机制

在生命体中，酶催化反应的正常进行高度依赖于其周围的微环境，尤其是pH值。然而，对于核仁等缺乏生物膜包裹的无膜细胞器而言，其内部如何形成并维持与周围细胞质不同的pH微环境，一直是一个难以直接探究的科学谜题。活细胞内环境的复杂性，使得直接在体内操控并观测无膜细胞器界面两侧的条件极具挑战性。

近日，东南大学商珞然课题组开发了一种基于凝聚层液滴的体外模型，揭示了液-液相分离过程本身有助于在类似无膜细胞器的腔室内建立pH差异。他们利用微流控技术制备了基于精氨酸和天冬氨酸多肽的均匀凝聚层液滴，发现液滴内部富含电荷的聚合物能够不均匀地吸引氢离子或氢氧根离子，从而形成类似于核仁的pH分区微环境。更有趣的是，这种pH差异会随着相分离状态的破坏而减弱甚至消失。基于此，研究团队通过向液滴内引入特定的酶，实现了对局部pH的宽范围精细调控，并成功驱动了级联反应，执行了聚合酶链式反应和体外转录翻译等基础分子生物学操作，展现了凝聚层作为原始细胞在模拟和调控细胞功能方面的巨大潜力。相关论文以“Coacervate droplets as pH-regionalized protocells”为题，发表在

Nature Communications

研究始于对生命基本单元——细胞的观察。研究人员以细胞核中最大的无膜凝聚体核仁为例，利用pH敏感荧光探针SNARF-4F，首次在多种细胞系中确认了核仁与核质之间存在细微但一致的pH差异：核仁略微偏酸（图1a）。进一步的药物干预实验发现，当使用CX-5461抑制核仁核心的RNA聚合酶I活性，或使用放线菌素D破坏核仁结构时，核仁的酸性特征减弱，其与核质之间的pH差也缩小甚至消失（图2）。这表明，核仁内的pH差异与其转录活性和相分离结构状态紧密相关。

图1. 无膜细胞器与基于凝聚层的原始细胞中的pH差异示意图。 a. 示意图展示活细胞中核仁与核质之间的pH差异，以及药物处理引起的核内pH微环境变化。 b. 示意图表明，与无膜细胞器类似，基于凝聚层的原始细胞能够建立pH差异。 c. pH分区化的原始细胞可用于精细调控后续生化酶促反应的效率。

图2. 不同生理条件下核仁与核质pH研究。 a. 示意图展示核仁pH、RNA聚合酶I活性、DNA复制及核仁相分离状态之间的关系。 b. 不同细胞经DMSO或CX-5461处理后，与SNARF-4F共孵育的代表性共聚焦荧光图像。 c-j. 在经（c-f）DMSO或（g-j）CX-5461处理的3T3、OC1、HELA和AML12细胞中，核仁与核质的580/640 nm发射信号强度分布图。(b) 中的白线标示了数据采集区域。c-j中的浅蓝色区域高亮了核仁位置。 k-n. 小提琴图展示经DMSO或CX-5461处理的（k）3T3、（l）OC1、（m）HELA和（n）AML12细胞的核仁pH定量结果。圆点代表核仁与核质的平均pH值。 o. HELA细胞经不同浓度放线菌素D处理后，用SNARF-4F染色的共聚焦荧光图像。 p. 经不同浓度放线菌素D处理的HELA细胞核内580/640 nm发射信号强度分布图。(o) 中的白线标示了数据采集区域。

为了在简化可控的体外系统中探究这一现象背后的物理化学原理，研究人员构建了由带正电的精氨酸十肽与带负电的天冬氨酸十肽通过静电作用形成的R10/D10凝聚层液滴模型（图3a）。他们发现，当向体系中加入微量酸或碱时，凝聚相与稀释相之间会迅速建立起显著的pH差：加入酸，凝聚相更酸；加入碱，凝聚相更碱（图3d）。分子动力学模拟揭示，这是由于带电荷的肽链网络对氢离子和氢氧根离子具有富集作用，且氢离子的富集偏好更强（图3j-n）。这种分区效应高度依赖于相分离的稳定性：提高肽链浓度增强相分离，pH差增大；提高盐浓度屏蔽静电作用破坏相分离，pH差则减小（图3e-i）。

图3. 在R10/D10凝聚层中重建pH差异。 a. 示意图展示凝聚浓度和盐浓度对两相间氢离子或氢氧根离子浓度差异的相反影响。 b. R10/D10混合溶液随各组分浓度变化的相图。 c. 10 mM R10/D10凝聚层溶液在不同pH值下的浊度。 d. 添加不同量氢离子或氢氧根离子后，凝聚相和稀释相的pH变化。 e. 状态图展示添加氢离子或氢氧根离子后，盐浓度和凝聚浓度对相同pH差异的影响。 f. 不同浓度R10/D10凝聚层溶液的浊度。 g. 将2 μmol氢离子或氢氧根离子与2 mL不同浓度的R10/D10凝聚层溶液混合后，凝聚相与稀释相间的pH差。 h. R10/D10凝聚层溶液在不同盐浓度下的浊度。 i. 将2 μmol氢离子或氢氧根离子与2 mL R10/D10凝聚层溶液混合后，在不同盐浓度下，凝聚相与稀释相间的pH差。 j. （上图）不同对数的R10和D10经过5 μs粗粒化分子动力学模拟后的状态快照。（下图）300对R10和D10在不同NaCl浓度下经过5 μs模拟后的快照。红色代表R10，蓝色代表D10。水分子未显示。 k. 模拟得到的不同凝聚浓度下的肽链-氢离子径向分布函数。 l. 模拟得到的不同凝聚浓度下肽链与离子的接触数。 m. 模拟得到的不同盐浓度下的肽链-氢离子径向分布函数。 n. 模拟得到的不同盐浓度下肽链与离子的接触数。

成功模拟pH分区现象后，研究的下一个目标是将这些液滴升级为功能性的“原始细胞”。关键在于能否将酶高效包裹并保持其活性。研究显示，葡萄糖氧化酶和脲酶能成功封装于R10/D10等多种凝聚层液滴中，且分布均匀（图4a,b）。微观尺度热泳分析及分子动力学模拟证实，酶主要通过静电作用与带正电的聚合物组分结合，从而被选择性富集在凝聚相内（图4c-n）。当加入相应底物（葡萄糖或尿素）后，封装在液滴内的酶发生反应，产生酸性或碱性产物，从而在液滴内部主动营造出与外部不同的pH微环境，且该差异可通过底物浓度进行调节（图5）。

图4. 蛋白质酶在凝聚层液滴中的分配亲和行为。 a. 示意图展示通过微流控生成包裹FITC-葡萄糖氧化酶的均匀R10/D10凝聚层微液滴，其中FITC-葡萄糖氧化酶（带负电）与R10（带正电）的相互作用促进了其封装。 b. FITC-葡萄糖氧化酶和RBITC-脲酶共封装于微流控生成的R10/D10凝聚层微液滴的荧光显微镜图像。 c. FITC-葡萄糖氧化酶与R10、DEAE-葡聚糖及PDDA的MST结合曲线。 d. FITC-葡萄糖氧化酶与D10、dsDNA及PAA的MST结合曲线。 e. R10/D10凝聚层与葡萄糖氧化酶体系经过5 μs粗粒化分子动力学模拟后的快照。浅色代表凝聚层组分，紫色代表葡萄糖氧化酶，水分子未显示。 f. R10与葡萄糖氧化酶溶液经过5 μs粗粒化分子动力学模拟后的最终构型快照。水分子未显示。 g. 模拟获得的R10-葡萄糖氧化酶径向分布函数和平均力势。 h. R10/D10凝聚层与脲酶体系经过5 μs粗粒化分子动力学模拟后的快照。浅色代表凝聚层组分，紫色代表脲酶，水分子未显示。 i. R10与脲酶溶液经过5 μs粗粒化分子动力学模拟后的最终构型快照。水分子未显示。 j. 模拟获得的R10-脲酶径向分布函数和平均力势。 k. D10与葡萄糖氧化酶体系经过5 μs粗粒化分子动力学模拟后的最终构型快照。为清晰起见，省略水分子。 l. 模拟获得的D10-葡萄糖氧化酶径向分布函数。 m. D10与脲酶体系经过5 μs粗粒化分子动力学模拟后的最终构型快照。为清晰起见，省略水分子。 n. 模拟获得的D10-脲酶径向分布函数。

图5. 构建基于R10/D10凝聚层的原始细胞。 a. 示意图展示负载葡萄糖氧化酶或脲酶的R10/D10凝聚层液滴作为原始细胞建立pH差异。 b. 在不同浓度氢离子/氢氧根离子存在下，本体溶液中葡萄糖氧化酶活性的米氏方程曲线。 c. 在不同浓度氢离子/氢氧根离子存在下，R10/D10凝聚层中葡萄糖氧化酶活性的米氏方程曲线。 d. 在不同浓度氢离子/氢氧根离子存在下，本体溶液中脲酶活性的米氏方程曲线。 e. 在不同浓度氢离子/氢氧根离子存在下，R10/D10凝聚层中脲酶活性的米氏方程曲线。 f. 添加氢离子或氢氧根离子后，葡萄糖氧化酶和脲酶在本体溶液及R10/D10凝聚层内的最大反应速率。

在此基础上，研究实现了对液滴原始细胞内酶级联反应的时序调控。例如，预先通过葡萄糖氧化酶反应降低液滴内部pH，可以显著抑制后续需要中性偏碱环境的脲酶活性；反之亦然（图6a-d）。这演示了如何通过上游反应产生的pH变化来调控下游反应，模拟了细胞内的信号传递与代谢调控逻辑。

更进一步，团队将这些pH可分区的原始细胞平台应用于复杂的生物分子合成过程。他们将PCR反应体系或体外转录翻译体系与载有酶的凝聚层液滴相结合。通过添加不同底物预先调节液滴内部的pH，他们发现液滴内的pH环境能显著影响DNA扩增效率（图6e）以及RNA和蛋白质的合成速率（图6f）。这表明，凝聚层提供的分区化微环境不仅能装载生物分子机器，还能通过物理化学参数（如pH）对其功能进行有效调控，重现了细胞在分区化空间内高效有序进行生物合成的基本特征。

图6. 用于级联酶促反应的R10/D10凝聚层原始细胞。 a. 示意图展示基于凝聚层的原始细胞工作机制：通过酶反应调节pH环境，可进一步控制下游酶反应活性。 b. 明场显微镜图像展示R10/D10凝聚层与不同试剂混合后的稳定性。 c. 负载葡萄糖氧化酶和脲酶的R10/D10凝聚层原始细胞在添加不同浓度底物后，其凝聚相的pH值。 d. 不同条件下葡萄糖氧化酶和脲酶的酶活性：“Coac”组代表酶在R10/D10凝聚层内的活性；“GOx-Coac”组展示了在同时负载50 nM葡萄糖氧化酶并补充10 mM葡萄糖的凝聚层中脲酶的活性；“Ure-Coac”组展示了在同时负载50 nM脲酶并补充10 mM尿素的凝聚层中葡萄糖氧化酶的活性。 e. (i) 来自在不同葡萄糖和尿素浓度下的凝聚层原始细胞的PCR产物凝胶电泳图。“No enzyme”组代表不含酶和凝聚层的反应。(ii) 在含有葡萄糖氧化酶或脲酶的R10/D10凝聚层中，PCR前添加不同浓度相应底物后，所获PCR产物量的荧光强度指示。 f. (i) 体外转录翻译反应后凝聚层原始细胞的荧光图像。(ii) 各组原始细胞荧光强度分布图。(i) 中的线条标示了数据采集区域。(iii) 体外转录翻译反应后与不同底物混合的凝聚层原始细胞的平均荧光强度，指示相对转录和翻译速率。(iv) 体外转录翻译反应后凝聚相与稀释相荧光强度比较，代表两相中的相对转录和翻译速率。

这项研究有力地揭示了液-液相分离不仅是生物分子组装的物理基础，其本身也能主动塑造并维持腔室化的化学微环境（如pH梯度）。基于凝聚层的原始细胞模型，为在体外模拟和研究无膜细胞器的形成、功能及其调控机制提供了一个强大而灵活的平台。未来，这类可编程的智能液滴系统不仅有助于深化对生命基本原理的理解，也将在合成生物学、药物递送和新型生物材料开发等领域展现出广阔的应用前景。