非洲猪瘟病毒DNA检测方案：实时荧光PCR技术的标准化操作流程

【JD-ZW216山东竞道光电厂家品质保障，值得信赖】一、实验前准备

　　样本采集与处理：

　　采集抗凝血、淋巴结或脾脏组织样本

　　组织样本按1:5比例加入PBS匀浆，取上清液待检

　　所有样本在2-8℃保存不超过24小时，长期保存需置于-70℃

　　核心试剂与仪器：

　　试剂盒：选用国家认证的ASFV荧光PCR检测试剂盒

　　主要仪器：实时荧光PCR仪、核酸提取仪、离心机、生物安全柜

　　耗材：无核酸酶离心管、带滤芯吸头、PCR反应管

　　二、标准化操作流程

　　第一步：核酸提取(30分钟)

　　在生物安全柜内，取100μL样本加入核酸提取裂解液

　　按照磁珠法或柱式法试剂盒说明书操作

　　最终洗脱获得50-100μL DNA模板，立即检测或-20℃保存

　　第二步：PCR反应体系配制(冰上操作)

　　采用20μL反应体系：

　　2×PCR预混液：10μL

　　引物探针混合液：2μL(针对ASFV p72基因保守区)

　　DNA模板：5μL

　　无核酸酶水：3μL

　　每个批次必须设置：

　　阳性对照：ASFV标准品

　　阴性对照：无核酸酶水

　　内标对照：监控提取与抑制情况

　　第三步：上机检测

　　按以下程序设置PCR仪：

　　预变性：95℃ 30秒

　　循环阶段(45个循环)：95℃ 5秒 → 60℃ 30秒(在此步骤收集荧光信号)

　　荧光通道选择：FAM通道检测病毒，HEX/VIC通道检测内标

　　三、结果判读标准

　　阳性：Ct值≤35，且有典型的S型扩增曲线

　　可疑：Ct值35-38，需重复检测

　　阴性：无Ct值或Ct值≥38，且内标正常

　　无效：阳性对照未检出或阴性对照出现扩增，实验需重做

　　四、质量控制要点

　　分区操作：严格遵循试剂准备区、样本处理区、扩增分析区三区分离

　　防污染措施：使用带滤芯吸头，实验后用10%次氯酸钠擦拭台面

　　人员防护：在生物安全二级(BSL-2)实验室进行，穿戴个人防护装备

　　仪器校准：每季度对PCR仪进行光路校准和温度验证

　　本标准化流程基于OIE推荐方法建立，可实现对非洲猪瘟病毒DNA的灵敏、特异检测，检测下限可达10拷贝/μL，为疫情早期诊断提供可靠技术支撑。