微源分享：降解杂质质谱解析思路及案例研究

强制降解试验中，常会生成多种降解产物，并非所有产物均需进行结构鉴定。如何筛选出需重点关注的“主要降解产物”是研究的第一步。

根据PhRMA白皮书草案及ICH Q3A/Q3B的相关指导，可依据药物的日剂量设定鉴定阈值。这一阈值体系为降解杂质的筛选提供了科学依据，确保研究资源集中于最具临床相关性的杂质。

PART/ 01.高分辨质谱解析降解杂质的基本思路

在众多分析降解杂质手段中，高分辨质谱凭借其高灵敏度、高质量精度和强大的结构解析能力，已成为降解杂质鉴定的核心技术。

分析方法的重现与适配

若原HPLC方法使用高沸点缓冲盐（如磷酸盐）或强酸（如甲磺酸），需将其转换为适用于质谱分析的LC-MS方法。常用的策略包括：

•使用挥发性缓冲盐（如乙酸铵、甲酸铵）替代非挥发性盐；

•在酸性条件下（pH<3），常用三氟乙酸作为添加剂，虽可能抑制电离，但通过降低其浓度（如至0.05%）仍可取得良好效果；

•仍无法满足分析需求，可考虑采用二维液相色谱技术实现分离与质谱检测的兼容。

降解产物分子式的确定

通过LC-MS分析获取降解样品的总离子色谱图后，常需结合紫外色谱图定位目标杂质峰。

由于质谱检测器位于紫外检测器之后，两者之间存在一定的延迟时间，这一特性可用于排除相邻峰的干扰。通过提取特定m/z的单离子色谱图，并与紫外色谱峰进行对比，可确认目标降解产物的质核比，进而借助质谱软件推测其分子式。

结构解析：二级质谱的应用

确定母离子后，通过碰撞诱导解离获取二级质谱碎片信息。其解析基于以下假设：

•结构相似的化合物具有相近的裂解规律；

•裂解行为受仪器条件（外因）和分子结构（内因）共同影响。

通过比对API的裂解途径，结合可能的降解机理（如水解、氧化等），可逐步推导降解产物的结构。例如，若API中含有酯键，其在碱性条件下可能水解为酸和醇，相应降解产物的质谱碎片应体现出分子量增加18（加水）或减少相应烷氧基片段等特征。

PART/ 02.常见降解反应机制与质谱解析策略

水解降解

水解是最常见的降解途径之一，涉及酯、酰胺、内酯、磺酰胺等官能团。例如：

酯类药物

在碱性介质中易水解为酸和醇，质谱中可观察到相应碎片峰；

酰胺类药物

如氯霉素，pH6.0左右最稳定，偏离此范围可能发生水解，质谱中可检测到胺或羧酸片段。

酯的形成(酯化)或酰胺键的形成恰是酯和酰胺水解的逆反应，就像前面讨论过的，逆反应将经历与水解反应相同的过渡态，因此酯化和酰胺化同样可在酸和碱的催化下进行。酯交换类似于水解反应，但水分的角色被醇替代。

图3.倍他米松水解在碱性条件下水解&酯化反应

氧化降解

氧化反应较为复杂，常涉及多种官能团，如醇、醛、酚、胺、硫醇等。典型机制包括：

双键与氢过氧化物加成

叔胺氧化为N-氧化物

伯胺/仲胺氧化为羟胺、亚胺或硝酮

醇氧化为醛/酮

进一步氧化为羧酸

质谱解析时需注意氧化引起的质量增加（如+16、+32等）以及特征碎片如[M+H-H₂O]⁺、[M+H-CO]⁺等的出现。

PART/ 03.案例解析：辅料引起的氧化降解

厄贝沙坦薄膜包衣中甲醛加合物的形成案例，展示了降解杂质可能不仅来源于API本身，还可能由辅料引发。聚乙二醇（PEG）类辅料降解之后产生的活泼的甲醛进一步引起的氧化降解反应。

问题发现：在厄贝沙坦薄膜包衣片中检出未知杂质，经LC-MS分析推测为甲醛加合物。

根源追溯：包衣材料中的聚乙二醇在储存过程中降解，释放出甲醛。

机制分析：甲醛与API中的伯胺基团发生Eschweiler-Clarke还原胺化反应，生成N-甲基化产物。

质谱证据：高分辨质谱显示加合物质核比较API增加12 Da（相当于CH₂）；二级质谱显示丢失甲醛碎片（-30 Da）及胺基相关断裂；结合对照试验，确认该杂质来源于PEG降解。

解决措施：更换为不含PEG的包衣材料后，该杂质未再检出。

此案例说明，降解杂质的解析需综合考虑API结构、处方组成及外界环境因素，质谱技术在此过程中发挥了关键作用。

PART/ 04.杂质制备与结构确认的资源与时间考量

若需通过核磁确认结构，常需毫克级纯品。以含量0.1%的杂质为例：

理论上需5g原料药（假设100%回收率）；

实际因回收率约50%，需至少10g；

采用半制备色谱分离，需多次进样耗时超27小时。

而若通过强制降解使该杂质含量提升至10%，则仅需1g样品、一次制备即可满足需求，时间可缩短至1小时。

凸显了强制降解试验在提高杂质丰度、加速结构鉴定方面的实用价值。

PART/ 05.总结

强制降解杂质的质谱解析是一项系统工程，涵盖方法适配、信号识别、分子式推断、结构推导及机理关联等多个环节。高分辨质谱与二级质谱技术的结合，为降解产物的快速识别与结构阐明提供了高效工具。

在实际研究中，应结合降解机理（尤其是水解与氧化），关注辅料可能引入的降解风险，并合理利用强制降解提升杂质丰度，以优化研究流程、节约资源。

通过科学系统的质谱解析思路与典型案例的实践，不仅可提升杂质研究的效率与准确性，也为药物处方优化、包装选择及稳定性评估提供了关键依据，最终服务于药品质量与患者安全。

微源检测技术团队专注药物杂质研究，为药品研发、生产及质量控制过程中，引入的中间体、副产物、残留溶剂，储存过程中产生的降解产物，以及包装材料迁移的污染物提供从杂质来源分析、结构推断、分离纯化到结构确证的全流程技术服务。

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