AbMole | 全合成纳米纤维水凝胶实现卵巢癌类器官无酶释放

在临床前癌症研究中，能够高度模拟患者肿瘤组织病理学特征、基因表达谱和对外界刺激应答的三维体外模型，其价值不言而喻。患者来源肿瘤类器官（PTOs）正是这样一种强大的工具，它源于患者自身的肿瘤细胞，在体外三维培养体系中自组织形成，被认为比传统的二维细胞系和患者来源肿瘤异种移植模型更能保留原始肿瘤的异质性。然而，当前PTOs培养的主流基质——基底膜提取物（如Matrigel），虽然提供了必要的生物化学支持，但其固有的批次间差异、成分不明确、机械性能可调性有限以及可能存在的异源成分污染等问题，制约了实验的可重复性、标准化以及对肿瘤微环境（TME）的精确模拟。因此，开发化学成分明确、性能可调控的全合成水凝胶作为替代基质，已成为该领域一个迫切且关键的研究方向。最近发表在《Biomaterials》上的一项研究，报道了一种全新的全合成热可逆纳米纤维水凝胶，为卵巢癌PTOs的培养和无损释放提供了创新性的解决方案。

该研究的核心是设计并制备了一种基于聚（甘油单甲基丙烯酸酯）-嵌段-聚（2-羟丙基单甲基丙烯酸酯）（PGMA-PHPMA）二嵌段共聚物的热可逆纳米纤维水凝胶（TNHs）。其设计理念巧妙地结合了多个维度需求：首先，通过聚合诱导自组装形成类似于细胞外基质中胶原纤维的纳米纤维结构，旨在模拟TME中至关重要的纤维网络拓扑结构，这种结构对于细胞间信号传导和机械转导具有深远影响。其次，该水凝胶具有独特的热可逆特性，其凝胶-溶胶转变温度（LCST）在生理温度附近，这意味着在37°C时呈凝胶态可用于三维培养，而降温至4°C时则液化，从而实现了对封装其中的类器官进行无酶、无机械损伤的“按需释放”。这一特性解决了从传统水凝胶（无论是天然基质还是聚乙二醇基合成水凝胶）中温和释放细胞的长期难题。

从具体的实验方法来看，研究团队首先通过可逆加成-断裂链转移聚合合成了PGMA55-PHPMA160二嵌段共聚物，并通过核磁共振氢谱和凝胶渗透色谱对其结构和分子量进行了确认。将冻干后的聚合物粉末溶解于磷酸盐缓冲液中，在37°C孵育即可形成不透明的TNHs水凝胶。流变学表征显示，当聚合物浓度达到70 mg mL⁻¹时，其储能模量（G‘）与常用的Matrigel相当，且表现出显著的应力松弛特性（松弛半衰期约44秒），这与天然细胞外基质的力学行为接近，有利于细胞在生长过程中的重塑。扫描电镜图像直观地证实了TNHs内部具有多孔结构和直径约为48.3纳米的纤维网络，与肿瘤微环境中的丝状结构相似。通过荧光漂白后恢复技术评估了水凝胶的渗透性，证实了不同分子量的探针（如FITC-葡聚糖和FITC标记的牛血清白蛋白）可以在其中扩散，确保了培养过程中营养物质的输送和代谢废物的排出。

在细胞培养方面，研究涵盖了从卵巢癌患者手术切除的实体瘤组织或腹水中分离的原代肿瘤细胞。分离流程包括组织剪碎、II型胶原酶消化、过滤去除杂质和红细胞裂解等标准步骤。为了支持PTOs的生长，培养基中添加了多种生长因子和信号通路调节剂，其中包括ROCK通路抑制剂Y-27632二盐酸盐，该试剂购自AbMole，用于提高原代上皮细胞的存活率和克隆形成能力，这是在类器官培养起始阶段的一个常用策略。将分离得到的单细胞或小细胞团块与预先在4°C液化的TNHs或Matrigel均匀混合，接种于孔板中并在37°C下形成包埋细胞的三维凝胶，随后覆盖特制的条件培养基进行培养。

研究团队系统地比较了在TNHs和Matrigel中培养的卵巢癌PTOs的多项指标。形态学观察表明，两种基质中培养的类器官均能形成，其形态谱系广泛，从囊状结构到致密球体均有出现，并且这种形态差异在同一患者来源的不同类器官以及不同患者来源的类器官之间均存在，很好地反映了肿瘤本身的异质性。对来自28例患者样本的培养成功率统计显示，TNHs组的成功率为68%，与Matrigel组的75%具有可比性。活死染色证实了在TNHs中培养的类器官细胞活性良好。更重要的是，通过简单的冷却操作即可将类器官从TNHs中完整释放，释放后的类器官在大小和形态上均未发生显著改变，且保持了高细胞活性，这为后续的分子生物学分析、高通量筛选或体内移植实验提供了极大的便利。

在功能验证层面，免疫荧光染色显示，从TNHs中释放的PTOs表达上皮细胞标志物E-钙黏蛋白、增殖标志物Ki-67以及卵巢癌诊断相关的标志物PAX8，其表达模式与患者临床信息相符。组织学分析（H&E染色）进一步证实，在TNHs中生长的PTOs成功复刻了亲本肿瘤组织的关键细胞学特征，如核多形性、核仁明显等。免疫组织化学染色对PAX8和p53蛋白的表达进行了验证，结果显示PTOs与对应原代组织在标志物表达上具有高度一致性。转录组测序分析为TNHs的等效性提供了更深入的证据。RNA-seq数据显示，与亲本肿瘤组织相比，在TNHs和Matrigel中培养的PTOs的基因表达变化模式相似，并且两者之间的差异基因极少。富集分析表明，两种培养条件下PTOs与原始组织之间差异基因所涉及的生物学通路（如细胞信号传导、代谢过程）也高度重合。值得注意的是，PTOs的基因表达谱与原始组织存在一定差异，这很可能是因为在优化于上皮细胞生长的培养条件下，原始肿瘤微环境中的免疫细胞、成纤维细胞等间质成分逐渐丢失，导致PTOs主要富集了上皮性肿瘤细胞群。

最后，体内成瘤实验是评估PTOs功能的关键一环。将从TNHs或Matrigel中释放并解离得到的单细胞皮下移植到免疫缺陷小鼠体内，两种来源的细胞均能形成移植瘤。肿瘤生长曲线显示，两者具有相似的生长动力学。对形成的移植瘤进行组织学分析，发现其保留了亲本肿瘤的组织结构特征和标志物（PAX8， p53）表达模式。这些结果强有力地证明了，在TNHs中培养的卵巢癌PTOs不仅能在体外模拟肿瘤的关键特性，也具备在体内重建肿瘤组织的能力，其效力与在Matrigel中培养的类器官相当。

综上所述，这项研究成功开发并验证了一种性能优异的全合成纳米纤维水凝胶TNHs，它集成了可调控的机械性能、仿生的纳米纤维结构、良好的物质渗透性以及独特的热可逆凝胶特性。该体系不仅克服了Matrigel的批次差异和成分不确定性问题，更通过无酶释放技术实现了对三维类器官的无损获取，极大地提升了后续实验操作的灵活性和类器官样本的完整性。实验数据从形态、组织病理、基因表达到体内功能等多个维度证实，TNHs能够支持卵巢癌PTOs的稳健生长，并有效维持其肿瘤异质性，是一种极具潜力的标准化、可定制的Matrigel替代方案。这项工作的意义不仅在于为卵巢癌研究提供了一个更优的体外模型平台，其设计原理和材料策略也为构建用于其他癌症类型乃至健康组织类器官培养的下一代合成水凝胶指明了方向，有望推动个性化癌症研究向更标准化、可重复和深入的方向发展。