没有增强Fc效应功能的“理想突变”

很多抗体的药理活性主要由其Fc段决定，包括与补体蛋白C1q结合可启动补体依赖细胞毒作用（CDC）。与白细胞上的Fcγ受体结合，则介导抗体依赖的细胞毒作用（ADCC）或抗体依赖的细胞吞噬作用（ADCP）。与新生儿Fc受体（FcRn）结合，使IgG获得较长的血清半衰期。

通过对Fc部位的点突变可以改变抗体与Fc受体的亲和力，以增强CDC、ADCC和/或ADCP活性。然而，尚缺乏对这些不同变体的系统比较。有研究以抗CD20抗体rituximab的Fab为固定骨架，构建了21株含不同Fc突变的抗体，并在细胞模型中系统比较了它们的活性。同时，评估了各变体的热稳定性，发现许多变体相比野生型有所下降。21株抗体对应的Fc突变，列表如下。

Fc效应细胞生物活性检测

使用Promega的Fc效应细胞生物活性报告基因检测系统，评估抗CD20抗体与细胞Fcγ受体的结合能力，从而间接反映其介导ADCP或ADCC的潜力。

靶细胞采用CD20阳性人B淋巴细胞系Raji，效应细胞用的是转染了特定人Fc受体，并携带由NFAT启动子驱动的荧光素酶报告基因Jurkat细胞系。

EC50值与野生型IgG1相比差异在3倍以内，视为“中性”；低于3倍，视为“增强”；高于3倍：视为“降低”。

结果总结于下表，主要发现如下：

野生型IgG3：尽管与重组Fc受体结合力强，但在所有ADCC/ADCP实验中活性极低。

FcγRI介导的ADCP：无变体表现出增强活性，部分明显降低。

FcγRIIIa介导的ADCC（两种等位基因）：22个变体中，14个表现出增强活性，尤其对158F等位基因（通常与IgG1结合较弱）增强更明显；5个活性降低，3个无显著变化。

FcγRII相关活性：7个变体无增强；12个仅对某一亚型或等位基因有增强；3个对所有三种形式均有增强。

补体依赖细胞毒作用（CDC）

使用Svari Lite检测系统评估全部变体的CDC活性。靶细胞采用表达CD20的人B细胞系Ramos，转染并表达Svar荧光素酶。

结果见上表，显示野生型IgG3与IgG1活性相当；11个变体与IgG1持平（绿色部分）；6个变体CDC增强（蓝色部分）；5个变体CDC减弱或几乎丧失（红色部分）。

热稳定性

采用Protein Stable SUPR-DSF系统的差示扫描荧光法（DSF）测定。

分析指标：Ton（起始熔解温度）；Tm（第一熔解峰温度，对应CH2结构域）

野生型IgG1：Ton=63.1℃；Tm=73.2℃

判定标准：Ton<61.9℃（<3×误差）为显著降低；Tm<72.6℃为显著降低

结果显示，22个变体中，18个Ton与Tm均显著降低，部分下降超过20℃；仅4个变体的热稳定性与野生型IgG1相当。

增强FcγR结合策略的根本目的是提高抗体杀伤肿瘤的效力，但究竟应优先增强ADCP（FcγRI或FcγRIIa介导）、ADCC（FcγRIIIa介导）、CDC，还是减弱抑制性受体FcγRIIb的负向调节信号，抑或多种效应联合优化，目前尚无定论，且“增强到何种程度”也缺乏共识。本研究采用了一组V区与IgG1同种异型完全一致的抗体（均以利妥昔单抗的V区为骨架），采用常规、可重复的细胞学实验（ADCC、ADCP、CDC）进行平行比较，并用高通量DSF检测热稳定性。所用变体涵盖WHO INN名单（截至2022年4月）、IMGT收录及文献报道的其他突变。

FcγRI受体与ADCP相关，研究显示，几乎没有专门增强FcγRI结合或ADCP的突变。测试的变体大多无明显提升；最强的增强仅为1.87倍（S239D/A330L/I332E），7个变体活性反而下降3倍以上。

提高ADCC的手段最早、最广泛应用的是降低Fc糖基化的岩藻糖含量，即去岩藻糖化（Afucosylation）。截至2023年底，FDA已批准7款去岩藻糖抗体（amivantamab、belantamab mafodotin、benralizumab、inebilizumab、mogamulizumab、obinutuzumab、ublituximab），通常通过在缺乏岩藻糖基转移酶的细胞系中表达实现。去岩藻糖变体在FcγRIIIa-158V效应细胞中ADCC提高31倍，在158F细胞中提高201倍；但ADCP（FcγRI或FcγRII各亚型）未见明显变化。

单点突变F243L与T393A，这两个单点突变单独存在时未显著提升ADCC、ADCP或CDC。它们最初是在核糖体展示筛选出的三突变体F243L/T393A/H433P中被认为对ADCC有贡献。T393A也出现在Fc融合蛋白conbercept中，但未给出选用理由。

CDC专用突变E430G与K326W/E333S，这两个变体专门设计用于增强CDC。E430G使CDC提高6倍，但ADCC与FcγRIIa介导的ADCP下降。K326W/E333S则使CDC提高7倍，伴随ADCC、ADCP下降。

多功能突变G236A/S267E/H268F/S324T/I332E，该五联突变对所有FcγRII亚型（包括抑制性FcγRIIb）的ADCP均增强，CDC也增强，但ADCC无显著变化。值得注意的是，它对FcγRIIb的提升高于FcγRIIa，这解释了为何以前用共表达两种受体的巨噬细胞检测时未观察到ADCP净增加。

S267E、S267E/L328F、N325S/L328F三种突变体对FcγRIIIa-介导的ADCC完全失活；对FcγRIIa-131H的ADCP基本不变，但可显著提升对FcγRIIa-131R和抑制性受体FcγRIIb的ADCP。CDC活性则各不相同：S267E提高3倍，S267E/L328F基本不变，N325S/L328F完全丧失。

14种突变体显著提升ADCC，且对低亲和力等位基因FcγRIIIa-158F的提升（17-333倍）远高于对高亲和力158V的提升（12-62倍）。

在ADCP与CDC方面，各突变体表现各异。L235V/F243L/R292P/Y300L/P396L，对FcγRIIa-131R无增强，但对131H与FcγRIIb有增强；CDC不变。S298A/E333A/K334A，ADCP不变，CDC增强；G236A/A330L/I332E与G236A/S239D/A330L/I332E，对两种FcγRIIa亚型均增强ADCP，但对FcγRIIb无变化且CDC完全丧失；G236A/H268F/S324T/I332E，ADCP类似，CDC轻度增强；S239D/K274Q/Y296F/Y300F/L309V/I332E/A339T/V397M与G236A/S239D/I332E，对所有FcγRII亚型均显著增强ADCP，CDC变化不大。值得注意的是，tafasitamab与talacotuzumab文献常仅提S239D/I332E，其实际序列为8突变体，活性远高于S239D/I332E双突变。S239D/A330L/I332E与S239D/I332E相比，对FcγRIIa-131R的ADCP降至野生型水平且CDC消失。P247I/A339Q、F243L/R292P/Y300L/V305L/P396I、D270E/K326D/A330M/K334E及异二聚体Fc(L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A//D270E/K326D/A330M/K334E）四种突变体均提升对FcγRIIa-131H的ADCP，对131R与FcγRIIb无变化；CDC则分别为下降8倍、上升6倍、基本不变、基本不变。

肿瘤治疗通常期望高ADCC且FcγRIIa:FcγRIIb激活/抑制比高。按此标准，G236A/S239D/A330L/I332E表现最优，但A330L使其CDC完全丧失；去掉A330L（G236A/S239D/I332E）可恢复CDC，却显著提高了对抑制性FcγRIIb的结合。若CDC必须保留，F243L/R292P/Y300L/V305L/P396I是较好折中方案。迄今为止，尚未出现同时理想提升ADCC、ADCP、CDC且无FcγRIIb副作用的“完美”突变。

还需要注意的是，各突变体的热稳定性普遍下降。22个变体中18个热稳定性显著降低，CH2结构域Tm最多下降21℃。活性最高的G236A/S239D/A330L/I332E与G236A/S239D/I332E恰是下降最严重者（≈20℃）。异二聚体Fc虽经过设计以提高稳定性，Tm仍下降约16°C。热稳定性降低可能影响生产、储运、聚集及免疫原性，需逐一评估。

与大量“沉默型”突变抗体已上市相比，真正进入临床的增强型突变极少。原因可能包括：可选方案过多，决策困难；热稳定性风险阻碍商业化。