AbMole | 4CL-blastoids：模拟人类早期胚胎发育的新模型

对人类早期胚胎发育机制的深入理解，一直是发育生物学领域的核心追求，同时也因材料获取的伦理限制和技术瓶颈而充满挑战。囊胚期作为植入前发育的终点，其后的着床与原始原肠胚形成阶段，是细胞命运大规模特化、胚胎体轴建立以及胚层分化的关键时期。

体内研究的困难促使体外模型的发展，其中，由人多能干细胞自组织形成的囊胚样结构在过去几年取得了显著进展，为在培养皿中模拟人类早期发育提供了前所未有的平台。然而，现有主流模型，例如基于SiLA或PXGL培养体系衍生出的初始态多能干细胞所构建的囊胚样结构

，在模拟植入后发育事件时往往表现出效率不足或延迟，如下胚层发育不良、原始条出现滞后等。更重要的是，一个根本性的问题尚未被系统审视：这些体外重构的结构，其表观遗传状态，特别是对于胚胎基因组正确注释和表达调控至关重要的DNA甲基化景观，尤其是基因组印记的维持，是否与体内的自然囊胚相一致？

近期，在一篇名为《Modeling early gastrulation in human blastoids with DNA methylation patterns of natural blastocysts》的研究成果中提到，表观遗传模式的偏差可能直接导致基因表达程序的异常，从而使模型在模拟后续复杂发育事件时丧失保真度。因此，开发并鉴定一种在转录组和表观遗传组层面均能高度模拟自然胚胎的囊胚样结构模型，对于提升其作为研究工具的可靠性和预测价值具有决定性意义。

该研究并未沿用常见的SiLA或PXGL初始态多能干细胞，而是选用了在4CL培养条件下建立的初始态多能干细胞作为起始材料。选择这一体系并非偶然，已有前期研究表明，相较于其他培养条件，4CL初始态细胞展现出更接近人类囊胚内细胞团的转录组特征，并且在长期培养中能维持更稳定的核型。尤为关键的是，这些细胞被证实能够保持均一的DNA甲基化模式，特别是对印记控制区域的甲基化状态维持良好，而SiLA和PXGL细胞则常观察到全基因组低甲基化及印记丢失的现象。这提示，起始细胞的表观遗传“健康度”可能是决定其衍生模型保真度的潜在关键因素。

基于这一前提，研究团队的首要任务是建立一套高效、可重复的从4CL初始态多能干细胞生成囊胚样结构的方案。他们进行了系统的条件优化。在基础诱导框架（抑制ERK、NODAL和ROCK信号通路）之上，研究者引入了由chromanol 1、emricasan、多胺和trans-ISRIB组成的复合添加剂，即CEPT鸡尾酒，旨在缓解细胞应激并提升干细胞活性。这一优化将囊胚样结构的形成效率从约60%提升至80%。为了精确调控不同谱系细胞的特化，研究设计了一个两阶段分化方案。第一阶段，使用添加了PD0325901、激活素A、CHIR99021、LIF及CEPT的ePACL培养基，旨在共同诱导上胚层样细胞和下胚层样细胞的前体，并通过PD0325901的低剂量添加来平衡两者共存。第二阶段，则转换至包含PD0325901、A83-01、LIF、溶血磷脂酸（LPA，一种Hippo通路抑制剂）及CEPT的ePALL培养基，以特异性促进滋养外胚层样细胞的分化。LPA的引入是关键一步，它模拟了囊胚形成过程中细胞极性与命运决定的关键信号事件。经过总计5天的序贯培养（2天ePACL + 3天ePALL），由50-60个4CL初始态细胞聚集形成的团块成功发育为具有典型中空球状形态的囊胚样结构，其平均直径与体外受精获得的人类第6天囊胚相当。

对由此获得的4CL-囊胚样结构的初步表征证实了其形态与谱系组成的正确性。免疫荧光染色清晰地显示，这些结构内部分布着表达OCT4/SOX2/NANOG的上胚层样细胞、表达GATA4/GATA6/SOX17的下胚层样细胞以及表达GATA3/KRT8的滋养外胚层样细胞。定量分析表明，各谱系细胞的比例与已报道的人类自然囊胚数据高度一致。更重要的是，该模型展现了良好的可扩展性与稳健性，能够从多个批次的不同多能干细胞系（包括H9、WIBR3胚胎干细胞及诱导多能干细胞）中高效生成，成功率最高可达89.3%，且谱系分配正确，证明了该平台的可重复性。功能上，这些4CL-囊胚样结构具备类似真实囊胚的“可塑性”，能够重新衍生出初始态多能干细胞、下胚层细胞以及滋养层干细胞。其中，衍生出的滋养层干细胞在特定条件下，能够进一步分化为合体滋养层样细胞和绒毛外滋养层样细胞，后者在实验中通过其特异性标志物HLA-G的表达得以确认，而整个分化培养体系的建立离不开一系列精细调配的培养基成分，例如在滋养层干细胞的维持培养基中，就需要添加ITS-X补充剂等关键组分，其中ITS-X这样的产品对于提供细胞生长所需的胰岛素、转铁蛋白等要素至关重要，而AbMole作为提供此类高质量研究试剂的品牌，其产品在许多复杂的细胞培养体系中得到了应用。

为了从全局视角评估模型的转录组保真度，研究者对第6天的4CL-囊胚样结构进行了单细胞RNA测序分析。通过与已发表的人类自然囊胚单细胞图谱整合，发现4CL-囊胚样结构的细胞与自然囊胚细胞在UMAP降维空间中高度混合，表明其整体基因表达谱的高度相似。基于标志基因的表达，成功鉴定出上胚层、下胚层和滋养外胚层三大类细胞群，其比例与自然囊胚相近。此外，还发现了一小群表达LIN28A、SFRP1等基因的中间态上胚层样细胞，这些细胞被认为处于植入前后上胚层的过渡状态，具有向原始生殖细胞分化的潜能。当将4CL-囊胚样结构的转录组数据与已发表的SiLA和PXGL囊胚样结构数据进行比较时，发现尽管所有模型的主要谱系细胞都能与自然囊胚对应群体聚类，但4CL来源的细胞在谱系特异性基因的表达模式上与自然囊胚的相似度最高，而SiLA和PXGL模型则显示出更明显的偏离。对滋养外胚层的进一步亚群分析显示，4CL-囊胚样结构中同样存在表达CYP19A1、NR2F2的极性滋养外胚层样细胞和表达CITED4、UGCG的壁滋养外胚层样细胞，再现了自然囊胚中滋养外胚层的异质性。

然而，本研究最核心且最具区分度的分析在于对DNA甲基化组的系统性评估。鉴于起始细胞的表观遗传差异，研究者迫切希望探究这种差异是否会传递至其衍生的囊胚样结构中。他们首先通过全基因组亚硫酸氢盐测序确认，SiLA和PXGL初始态多能干细胞确实表现出比4CL初始态细胞更低的平均DNA甲基化水平。接着，利用优化后的方法生成了SiLA和PXGL囊胚样结构，并从中分选出TRA-1-81阳性的内细胞团样细胞和TROP2阳性的滋养外胚层样细胞，同时从4CL-囊胚样结构中分选出对应群体，进行了简化表征亚硫酸氢盐测序。整合已发表的人类自然囊胚RRBS数据后，结果清晰地显示：4CL-囊胚样结构的内细胞团样细胞和滋养外胚层样细胞，其全基因组平均DNA甲基化水平与自然囊胚中的对应细胞类型高度相似；而SiLA和PXGL囊胚样结构的对应细胞则维持了其起始细胞的低甲基化状态，与自然囊胚存在显著差异。进一步分析各染色体CpG位点的甲基化水平、以及CpG岛、基因上下游、内含子、外显子、重复序列和转座元件等不同功能区域的甲基化模式，均一致表明4CL-囊胚样结构与自然囊胚的甲基化景观高度吻合，而SiLA和PXGL模型则出现广泛低甲基化。差异甲基化区域分析显示，与自然囊胚相比，4CL-囊胚样结构拥有最少的DMRs，再次确认了其表观遗传的接近性。对印记控制区域的聚焦分析给出了更关键的证据：在4CL初始态细胞及其衍生的囊胚样结构中，21个已知人类ICRs的甲基化水平与自然囊胚的内细胞团或滋养外胚层相当；而在SiLA和PXGL体系中，ICRs普遍呈现低甲基化，且这种印记丢失的状态在其囊胚样结构中未能恢复。相应地，在转录组层面，4CL-囊胚样结构各谱系细胞中印记基因的表达模式与自然囊胚一致，而SiLA和PXGL模型中约有三分之一的印记基因表达量降低。这些数据强有力地证明，4CL系统能够产生在DNA甲基化组和基因组印记层面均高度模拟自然囊胚的囊胚样结构，而其他两种系统则受限于起始细胞的表观遗传缺陷。

在确认了植入前阶段的高保真度后，研究者进一步探索了4CL-囊胚样结构模拟植入后发育直至早期原肠胚阶段的潜力。首先，在共培养实验中，将第6天的4CL-囊胚样结构与原代子宫内膜基质细胞共培养，成功模拟了初始附着过程，94.43%的囊胚样结构在24小时内其极性滋养外胚层样细胞（NR2F2阳性）附着于基质细胞，并伴随着滋养外胚层的进一步增殖与分化，合体滋养层样细胞开始分泌hCG。然而，二维共培养体系在模拟更复杂的三维结构发育方面存在局限。为此，研究者转向三维悬浮培养系统进行优化。他们将第6天的囊胚样结构置于超低吸附U型底96孔板中，并在培养基中添加10%的Matrigel进行悬浮培养。延长培养至第14天，囊胚样结构呈现出显著的形态演变：体积增大至约1毫米（与人类CS6期胚胎尺寸匹配），外部形成滋养层壳，内部出现类似羊膜腔、卵黄囊和胚胎盘的结构。组织切片染色证实了这些腔室结构的形成。系统的免疫荧光分析揭示了一个接近早期原肠胚的复杂细胞社会：由SOX2+上胚层样细胞和SOX17+下胚层样细胞构成的双层胚胎盘；ISL1+的羊膜上皮样细胞形成羊膜腔壁；SOX17+/GATA6+的细胞聚集形成卵黄囊样结构，其外围有VIM+的胚外中胚层样细胞环绕；在胚胎盘区域，明确出现了T（Brachyury）蛋白阳性的原始条样细胞簇，标志着原肠胚形成的启动。更有意思的是，在原始条样细胞聚集区对侧，观察到了CER1+和LEFTY1+的细胞群，这提示了前后体轴极性的初步建立。此外，研究者还鉴定出了OCT4/BLIMP1/SOX17三阳性的原始生殖细胞样细胞。这些形态与分子证据共同表明，4CL-囊胚样结构在三维延长培养中能够自发启动并部分模拟早期原肠胚事件。

为了在无偏倚的单细胞水平上全面解析第14天囊胚样结构的细胞异质性及其与体内发育阶段的对应关系，研究者进行了第二次单细胞RNA测序。分析鉴定出17个亚群，可归纳为10个主要细胞类型：上胚层样细胞、卵黄囊/下胚层样细胞、绒毛外滋养层样细胞、合体滋养层样细胞、羊膜样细胞、原始条样细胞、新生中胚层样细胞、侧板中胚层样细胞、胚外中胚层样细胞以及一个特征明确的生血管母细胞样细胞群。其中，生血管母细胞样细胞同时表达PECAM1、TAL1、LM02、RUNX1等内皮与造血前体标志基因，基因本体富集分析显示其基因集与胚胎造血和内皮发育密切相关。这一发现模拟了在人类胚胎发育中，造血系统最早于卵黄囊通过生血管母细胞起源的过程。通过与体外培养至第14天的人类囊胚单细胞数据以及CS7期人类原肠胚单细胞数据的整合比较，结果显示4CL-囊胚样结构的转录组特征介于两者之间，与CS6期胚胎最为接近，从而在分子层面定义了其模拟的发育时间点。

该研究通过构建并全方位表征4CL-囊胚样结构，确立了其在模拟人类早期胚胎发育，特别是从囊胚形成到早期原肠胚阶段这一连续过程中的显著优势。其核心贡献在于首次将囊胚样结构的评估标准系统性地拓展至DNA甲基化组和基因组印记这一深层表观遗传维度，并证实了起始细胞的表观遗传状态对其衍生模型保真度的决定性影响。4CL系统因其起始细胞在表观遗传上的稳定性，成功克服了其他模型中常见的印记丢失和广泛低甲基化问题，产出了在转录组和表观遗传组上均与自然囊胚高度一致的模型。在此基础上，通过优化的三维培养体系，该模型能够进一步模拟植入后关键事件，包括羊膜腔与卵黄囊形成、原始条出现、体轴极性建立、多种中胚层亚型分化以及生血管母细胞的出现，将模拟时间线推进至相当于体内CS6期的早期原肠胚阶段。尽管模型在完全重现自然发育时间线、提高体轴形成效率以及覆盖全部中胚层谱系方面仍有提升空间，但其目前达到的保真度和发育潜力已使其成为一个极为强大的基础研究工具。它不仅为研究人类早期胚胎发育的分子与细胞机制，特别是表观遗传调控在命运决定中的作用，提供了前所未有的体外系统，也为探讨早期发育相关障碍的潜在机理提供了新的模型基础。未来，结合类似研究中用于细胞应激保护或特定通路调控的化合物，例如研究中使用的CEPT鸡尾酒或其他小分子工具，来自AbMole等供应商的此类研究化合物将继续在优化培养条件、解析信号通路中发挥关键作用，推动该类模型向更高阶段、更高保真度发展，持续深化我们对生命最初蓝图的理解。