FSHW | 新型Ag@Cu-MOF复合抗菌材料用于控制猪肉大肠杆菌O157:H7的抑菌机制研究

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Introduction

食源性致病菌广泛存在于人们的日常生活当中，威胁人类的生命健康，并给食品工业带来巨大的经济损失。大肠杆菌O157:H7（E. coli O157:H7）被认为是一个全球性的公共卫生问题，会导致溶血性尿毒综合症和血性腹泻，死亡率很高。因此新型食品可接触抗菌材料的研发变得尤为重要。

金属有机框架（MOFs）作为一类高度有序晶态多孔材料，表现出高比表面积、大孔径和低密度等特点。MOFs独特的结构使其在功能应用研究方面更具有多元性，通过预处理技术对MOFs进行改性处理，可以改善MOFs自身的局限性，进一步提高材料的性能。MOFs可用作金属离子的储存库，其抗菌活性源于框架中阳离子形式的金属，通过其框架结构的生物降解而逐渐缓释出具有抗菌活性的金属离子，有效避免了高浓度金属离子的毒性。MOFs作为一种新型抗菌材料，其抗菌活性的研究尚处于起步阶段，在构建安全、低成本、灵敏性的抗菌材料方面具有非常广阔的应用前景。

西北农林科技大学食品科学与工程学院单忠国课题组利用两步合成法构建双金属中心复合抗菌剂体系，将抗菌性金属离子Ag+包封入Cu-MOF中原位还原为Ag纳米颗粒（NPs），合成出抗菌性增强的双金属中心复合抗菌剂Ag@Cu-MOF。同时，以E. coli O157:H7作为模型菌株，研究了Ag@Cu-MOF抗菌机制以及对生物被膜活性的影响，以猪肉为模型对Ag@Cu-MOF在E. coli O157:H7抑制方面的应用前景进行了探究。

图1 Ag@Cu-MOF的制备及其对猪肉E. coli O157:H7的抑制机理研究

Result

Cu-MOF与Ag@Cu-MOF的表征

Cu-MOF的单晶结构呈单斜P21/c空间群。Cu-MOF的一个不对称单元还包含两个五配位Cu2+离子、一个μ3-OH-阴离子、一个去质子化tzia3-和一个配位DMA分子（图2A）。由两个μ3-OH-阴离子连接四个Cu原子，形成中心对称的四核簇[Cu4(OH)2(COO)4(tetrazolate)2]。相邻的四核簇由tzia3-配体延伸形成三维框架，沿（101）方向形成一维矩形通道（图2B），形成(3,6)连接rtl拓扑网络，点符号为(4·62)2(42·610·83)（图2C）。PLATON计算Cu-MOF的有效孔隙率为32.2%。通过PXRD、TG、XPS、SEM、TEM、IR、元素分析和ICP-OES对Ag@Cu-MOF进行进一步表征（图2D-I）。SEM图显示Cu-MOF和Ag@Cu-MOF均为规则条状，宽度尺寸约为10 μm，Ag@Cu-MOF形貌并未发生明显改变（图3A-B）。Ag@Cu-MOF的SEM图中没有Ag NPs，而在其TEM图中可见Ag NPs，尺寸约为10 nm（图3C-E）。由此推测Ag NPs位于Cu-MOF的孔隙中而不是表面。Ag@Cu-MOF的TEM‒EDS元素面扫描图明显证实了Ag NPs在Cu-MOF中均匀分布（图3F-H）。

图2 (A)Cu-MOF中Cu2+在四核簇中配位结构示意图；(B)Cu-MOF沿(101)方向的三维框架结构图；(C)Cu-MOF的rtl拓扑网；(D) PXRD图谱；IR图谱(E)和TGA曲线(F)；Ag@Cu-MOF(G)、Cu2p(H)和Ag3d (I)的XPS光谱

图3 Cu-MOF(A)和Ag@Cu-MOF(B)的SEM图；(C-E)Ag@Cu-MOF的TEM图；(F)Ag@Cu-MOF和Cu-MOF的EDX谱图；Ag@Cu-MOF(G)和Cu-MOF(H)元素面扫描图

溶血活性和稳定性评估

基于溶血试验对Ag@Cu-MOF和有机配体H3tzia的生物安全性进行评价。800 μg/mL H3tzia处理后，77.2%以上的红细胞保持完整，说明高浓度时溶血活性很小。Ag@Cu-MOF的溶血率仅为0.07%，远低于允许极限(5%)。利用ICP-OES测定Ag@Cu-MOF中的Cu2+和Ag+，评价Ag@Cu-MOF和Cu-MOF的稳定性（表1）。当Ag+从Ag@Cu-MOF中释放出来时，Ag@Cu-MOF水溶液(1 mg/mL)中的Cu2+几乎是恒定的。Ag@Cu-MOF即使在800 μg/mL的高浓度下也不能引起溶血。上述结果表明Ag@Cu-MOF可能有利于Ag+的缓慢和控制释放，溶血率可以忽略不计。

表1 Cu-MOF与Ag@Cu-MOF的ICP分析结果

Samples

Amount of Cu2+ (%)

Amount of Ag+ (%)

Cu-MOF

19.9

0

Ag@Cu-MOF

19.4

2.8

体外抗菌活性

H3tzia浓度为>1 mg/mL时不能抑制细菌生长，Cu-MOF只有在高浓度时才具有抑菌活性。相比之下，Ag@Cu-MOF具有显著的抑菌活性，MIC为200 μg/mL。生长曲线实验显示Ag@Cu-MOF的抑菌效果随着浓度的增加而增强（图4A）。细菌细胞存活率与Ag@Cu-MOF浓度呈线性关系（图4B）。结果表明Ag@Cu-MOF不仅能影响E. coli O157:H7的生长还能诱导其死亡。

图4 E. coli O157:H7生长曲线与存活率

Discussion

细胞膜破损程度与Ag@Cu-MOF浓度增强呈正相关（图5A），表明膜结构明显受损。通过扫描电镜观察了细胞形态的变化（图5B）。对照组大肠杆菌O157:H7细胞结构完整，呈棒状，外观光滑、细胞膜完整。当Ag@Cu-MOF浓度增加到100和200 µg/mL时，部分细胞出现明显的形态变化，细胞出现皱缩、表面出现囊泡以及膜的全面破损，结果与SYTO 9/PI测定结果一致。此外，Ag@Cu-MOF在50、100、200和400 µg/mL浓度下，细胞内ATP水平分别比对照细胞降低了39.2%、81.7%、87.7%和91.3%（图5C）。Ag@Cu-MOF中含有Ag+和Cu2+，对E. coli O157:H7具有持续的抗菌作用。

图5 E. coli O157:H7细胞膜完整性（A）、形态（B）和胞内ATP（C）

Ag@Cu-MOF对E. coli O157:H7生物被膜作用机理

即使在25 μg/mL的低浓度下，Ag@Cu-MOF的存在也能对E. coli O157:H7生物被膜产生抑制和清除作用（图6A和6B）。CLSM图显示Ag@Cu-MOF处理后生物被膜的完整性结构被破坏（图6C和6D），表明Ag@Cu-MOF可以穿透生物被膜基质杀死E. coli O157:H7。

图6 E. coli O157:H7生物被膜作用机理

对E. coli O157:H7生物被膜活性和细菌基因表达的影响

Ag@Cu-MOF明显降低了E. coli O157:H7在生物被膜形成过程中的XTT转化率（图7A），表明Ag@Cu-MOF显著降低了生物被膜细胞的生存能力。Ag@Cu-MOF处理后可显著降低已形成的生物被膜细胞的代谢活性（图7B）。Ag@Cu-MOF通过影响E. coli O157:H7的代谢能力以及抑制生物被膜相关基因的表达，从而发挥其抗生物被膜功能（图7C）。

图7 Ag@Cu-MOF对E. coliO157:H7生物被膜活性和细菌基因表达的影响

对猪肉储存的影响

Ag@Cu-MOF对新鲜猪肉在4 ℃贮藏至12 天内E. coli O157:H7的抑菌活性（图8）。在猪肉样品中发现Ag@Cu-MOF对E. coli O157:H7具有明显生长抑制作用。在冷藏12天期间，E. coli O157:H7细胞浓度从2.4 log CFU/cm2增加到3.7 log CFU/cm2。与对照组相比，Ag@Cu-MOF在1，2和4 µg/cm2时，细菌数量分别减少至3.6, 2.7和2.2 log CFU/cm2 。

图8 猪肉模型中E. coli O157:H7的细菌数

Conclusion

本研究采用沉积还原法合成了Ag@Cu-MOF，具有良好生物相容性，并对E. coli O157:H7的灭活效果。Ag@Cu-MOF对E. coli O157:H7生物被膜形成具有明显抑制和破坏作用。Ag@Cu-MOF可以显著延缓E. coli O157:H7在新鲜猪肉中增长繁殖，延长新鲜肉的保质期，可以作为控制食源性致病菌的重要技术手段。

作者简介

第一作者

杨栋博，男，西北农林科技大学食品科学与工程学院2019级本科生，食品科学与工程专业。

易靖，男，现为西北农林科技大学食品科学与工程学院硕士研究生，主要研究方向为食品安全危害识别控制。

通信作者

单忠国，男，西北农林科技大学食品科学与工程学院讲师，研究生导师。主要研究食品安全危害识别控制，目前主持陕西省自然科学基金青年项目、中国博士后科学基金面上项目、校企合作横向课题项目、陕西省专项经费和西北农林科技大学博士科研启动项目，参与国家级和省部级科研基金项目4 项。以第一作者或通信作者发表文章10余篇，授权发明专利1 件。

王海华，女，西北农林科技大学食品科学与工程学院副教授，研究生导师。主要研究新型功能纳米材料的设计合成及其在食品领域内的安全检测、可控识别及其抗菌机理。近五年主持国家自然科学基金青年项目、陕西省重点研发计划项目、陕西省基础科学研究计划青年项目、安徽省先进纤维材料工程研究中心开放课题、陕西省专项经费和西北农林科技大学博士科研启动费项目，参与多项国家级和省部级科研基金项目。以第一作者或通信作者发表文章20余篇，授权发明专利5件。

Novel silver nanoparticles loaded Cu-based metal-organic framework as a promising antimicrobial material for controlling Escherichia coli O157:H7 in pork

Dongbo Yang1, Jing Yi1, Xiaoya Li, Shuqi Zhang, Yiming Xiang, Xingxing Liu, Zhongguo Shan*, Haihua Wang*

College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China

1These authors contribute equally.

*Corresponding authors.

Abstract

DThe risk of infection following consumption of foodborne pathogens contaminated foods became a significant concern for human health and imposes great economic losses to food industry. Herein, Ag nanoparticles were integrated to Cu-based metal-organic framework (Cu-MOF) for antibacterial activity. The crystal structure, morphology and composition of the prepared composite Ag@Cu-MOF were confirmed by powder X-ray diffraction, thermogravimetric analysis, scanning electron microscope, transmission electron microscope, Fourier transform infrared spectroscopy, and X-ray photoelectron spectroscopy. Antibacterial assays revealed that Ag@Cu-MOF exhibited increased inhibitory activity against Escherichia coli O157:H7 in comparison to Cu-MOF. Ag@Cu-MOF treated bacterial cells displayed distinct morphological changes, a decreased ratio of live/dead cells, as well as a reduction of intracellular ATP. Antibiofilm studies demonstrated that Ag@Cu-MOF could dramatically inhibit biofilm formation and disrupt preformed biofilms by interfering the metabolic activity and decreasing the expression of biofilm-associated genes. Food contamination model illustrated that Ag@Cu-MOF significantly prevented the growth of E. coli O157:H7 in packed pork. This study sheds light on the potential of Ag@Cu-MOF as a promising antimicrobial material for preserving pork.

Reference:

YANG D B, YI J, LI X Y, et al. Novel silver nanoparticles loaded Cu-based metal-organic framework as a promising antimicrobial material for controlling Escherichia coli O157:H7 in pork[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(3): 9250060. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250060.

本文编译内容由作者提供

编辑：王佳红；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意