疫苗前沿 | 新型脂质实现mRNA癌症疫苗的高抗原表达和低炎症反应

文献题目：Low reactogenicity and high tumour antigen expression from mRNA-LNPs with membrane-destabilizing zwitterionic lipids（具有膜破坏性两性离子脂质的mRNA-LNP具有低反应原性和高肿瘤抗原表达）

发表期刊：

Nature Biomedical Engineering

研究团队：康奈尔大学江绍毅教授团队

主要研究结果：研发出一种膜破坏性两性离子（MeDZ）可电离脂质，将其整合到脂质纳米颗粒（LNP）递送系统中用于包封mRNA，在生理pH下保持良好生物相容性，在内涵体酸性环境中快速质子化，促进mRNA高效表达；同时显著降低注射部位炎症反应和中性粒细胞浸润，在小鼠黑色素瘤模型中实现肿瘤发生预防、肺转移抑制、肿瘤生长干预及复发减少，且与免疫检查点阻断疗法协同增效，为mRNA癌症疫苗的临床转化提供了新方案。

研究背景

当前mRNA癌症疫苗走向临床应用的两大核心障碍尤为突出。其一，是mRNA表达效率有限。mRNA疫苗进入细胞后，大多被内涵体捕获，难以逃逸到细胞质中发挥作用，而癌症疫苗对肿瘤抗原的表达量要求更高，需要更高效的内涵体逃逸机制才能满足治疗需求。其二，是不可避免的炎症反应（反应原性）。脂质纳米颗粒（LNP）作为mRNA递送的关键载体，其成分尤其是可电离脂质，容易引发注射部位红肿、疼痛等局部炎症。

以上现状促使研究团队致力于开发新型递送系统。

核心内容详解

（一）MeDZ脂质的设计与LNP合成

研究方法

研究团队基于两性离子材料的优良生物相容性和可电离脂质的pH响应特性，设计了MeDZ脂质的独特结构：采用吡啶基羧酸甜菜碱（PyCB）作为亲水头基，搭配可降解的疏水性多尾烷基链和叔胺连接体。合成过程通过化学偶联反应将各功能结构域连接，经核磁共振（NMR）光谱验证结构正确性，并通过动态光散射、透射电镜等技术表征其物理化学性质。

为构建MeDZ LNP，研究团队改良了商业化BNT162b2 LNP的配方，用MeDZ脂质逐步替换原有ALC-0315可电离脂质，调整摩尔比例从0%到50%，制备系列MeDZ LNP制剂，并对其粒径、zeta电位、等电点（pI）、mRNA包封效率及细胞毒性进行检测。

实验结果

MeDZ脂质的PyCB头基在生理pH（7.4）下可与水形成氢键复合物，呈现两性离子特性；当pH低于6.8（接近内涵体pH 5.9~6.2）时，快速转化为带正电的质子化状态（PyCB–H₃O⁺），且计算模拟证实该质子化状态热力学更稳定。

系列MeDZ LNP制剂的粒径均在100~120 nm，与BNT162b2 LNP相近，mRNA包封效率均超过80%，细胞毒性可忽略不计。其中，MeDZ（25%）LNP的等电点为6.61，在后续实验中表现出最佳的mRNA递送效能。

（二）体外效能评估

研究方法

mRNA 表达效率检测：将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）mRNA封装于不同比例MeDZ LNP中，与DC2.4细胞共孵育，通过流式细胞术检测EGFP荧光强度，评估mRNA表达水平。

细胞摄取实验：采用Cy5标记的mRNA制备LNP，孵育DC2.4细胞后检测细胞内Cy5荧光强度，分析细胞摄取能力。

内涵体逃逸验证：通过Förster共振能量转移（FRET）实验评估LNP对内涵体模拟脂质体的破坏能力；利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察NBD标记LNP与LysoTracker红染色内涵体的共定位情况，计算Pearson共定位系数；通过溶血实验检测LNP在酸性条件下的膜破坏活性。

抗原呈递检测：将卵清蛋白（OVA）mRNA封装于MeDZ LNP，转染BMDCs后，通过Western blot检测OVA蛋白表达量，流式细胞术检测细胞表面MHC-I分子呈递的OVA抗原片段（H2Kb-SIINFEKL）水平。

实验结果

MeDZ（25%）LNP在DC2.4细胞中的EGFP表达效率达到BNT162b2 LNP的 1.7 倍，且细胞摄取能力与BNT162b2 LNP相近，证实其高效表达源于内涵体逃逸效率的提升。

FRET实验显示，在pH 6.0条件下，MeDZ LNP对内涵体模拟脂质体的破坏率显著高于BNT162b2 LNP。

CLSM结果显示，MeDZ LNP组的NBD荧光与LysoTracker红荧光共定位系数（0.78）低于BNT162b2 LNP组（0.90），表明更多mRNA逃逸到细胞质中。溶血实验进一步证实MeDZ LNP在内涵体pH下具有更强的膜破坏活性。

在抗原呈递实验中，MeDZ LNP转染的BMDCs中OVA蛋白表达量显著高于BNT162b2 LNP组，细胞表面H2Kb-SIINFEKL高表达细胞比例达到16.0%，远高于BNT162b2 LNP组的9.26%，为后续激发特异性T细胞应答奠定了基础。

（三）体内递送与安全性评估

研究方法

体内mRNA表达检测：将萤火虫荧光素酶（Luc）mRNA与 DiR标记的MeDZ LNP经皮下注射到C57BL/6小鼠尾基部，6小时后通过IVIS成像系统观察淋巴结中荧光素酶表达和LNP分布。

细胞靶向性验证：向Ai14小鼠皮下注射Cre mRNA负载的MeDZ LNP，48小时后收集腹股沟淋巴结，流式细胞术检测不同免疫细胞中tdTomato阳性细胞比例，明确LNP的靶向细胞类型。

反应原性评估：C57BL/6小鼠皮下注射MeDZ LNP后3天，收集注射部位皮肤组织，通过Luminex技术检测炎症细胞因子（GM-CSF、IL-1β、IL-6）水平，流式细胞术分析CD45+细胞中中性粒细胞比例，HE染色观察组织炎症病理变化；检测血清中谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平评估肝毒性。

低炎症机制探究：通过Western blot检测DC2.4细胞中NF-κB通路激活情况，结合RNA测序分析差异表达基因，探究MeDZ LNP低炎症反应的分子机制。

实验结果

体内成像结果显示，MeDZ（25%）LNP在淋巴结中聚集并表现出最高的荧光素酶表达效率，内涵体逃逸效率达到BNT162b2 LNP的1.7倍。

Ai14小鼠实验证实，MeDZ LNP可高效靶向淋巴结中的抗原呈递细胞，5.06%的树突状细胞和4.57%的巨噬细胞成功表达tdTomato。

安全性评估显示，MeDZ LNP组注射部位皮肤组织的GM-CSF、IL-1β、IL-6水平仅为BNT162b2 LNP组的 41.8%~65.7%，中性粒细胞浸润比例显著降低，皮肤红肿等炎症表现明显减轻；血清ALT和AST水平无显著升高。

机制研究发现，MeDZ LNP对DC2.4细胞中NF-κB通路的激活作用显著弱于BNT162b2 LNP，RNA测序显示其主要激活抗原加工呈递通路，而炎症相关通路激活程度温和。

小结

MeDZ LNP 经皮下注射后可高效靶向淋巴结中的抗原呈递细胞，在实现 mRNA 高效表达的同时，显著降低载体的反应原性。

（四）肿瘤防治效能评估

研究方法

预防性实验：C57BL/6小鼠分别接种PBS、BNT162b2 LNP-OVA mRNA、MeDZ LNP-OVA mRNA，第0天初免，第5、10天加强免疫，第14天检测血清OVA特异性IgM 和IgG水平；第15天接种B16F10-OVA肿瘤细胞，监测肿瘤生长情况；流式细胞术检测淋巴结中抗原呈递水平、血液中OVA特异性CD8+ T细胞比例及脾脏中记忆 T 细胞亚群（TEM、TCM）比例。

肺转移抑制实验：小鼠静脉接种B16F10-OVA肿瘤细胞后，第1、6、11天接种不同疫苗制剂，第20天处死小鼠，观察肺组织肿瘤结节形成情况并进行HE染色分析。

复发干预实验：小鼠静脉接种B16F10-OVA肿瘤细胞并接种MeDZ LNP疫苗后，第30天在左右侧分别皮下接种B16F10-OVA和EO771肿瘤细胞，监测两种肿瘤的生长情况，流式细胞术检测肿瘤组织中CD8+ T细胞浸润和OVA特异性T细胞比例。

治疗性实验：小鼠皮下接种B16F10-OVA肿瘤细胞6天后，分别接种不同疫苗制剂，监测肿瘤生长和小鼠存活情况；另设联合治疗组，在疫苗接种当天及后续加强免疫后1天腹腔注射抗PD-1抗体，评估协同治疗效果。

实验结果

预防性实验中，MeDZ LNP疫苗组小鼠血清OVA特异性IgG水平显著高于BNT162b2 LNP组，接种肿瘤细胞后全部小鼠无肿瘤生长，而BNT162b2 LNP组4/6只小鼠实现完全应答。

流式细胞术显示，MeDZ LNP组淋巴结中树突状细胞表面H2Kb-SIINFEKL高表达比例达4.97%，血液中OVA特异性CD8+ T细胞比例为2.80%，脾脏中TEM和TCM细胞比例显著升高。

肺转移实验中，PBS组小鼠肺组织出现大量肿瘤结节，BNT162b2 LNP组结节数量显著减少，而MeDZ LNP组肺组织未观察到肿瘤结节。

复发干预实验显示，MeDZ LNP疫苗可完全抑制B16F10-OVA肿瘤复发（5只小鼠中3只无肿瘤生长），但对非同源EO771肿瘤生长抑制作用微弱，证实其激发的免疫应答具有抗原特异性；肿瘤组织中CD8+ T细胞浸润比例达40.2%，OVA特异性T细胞比例为5.52%，显著高于PBS组。

治疗性实验中，MeDZ LNP疫苗组小鼠肿瘤生长显著抑制，40天存活率达40%，而PBS组和BNT162b2 LNP组存活率均为0；与抗PD-1抗体联合治疗后，6只小鼠中3只实现肿瘤完全抑制，60天存活率提升至50%，显著优于单独治疗组。

实验小结

MeDZ LNP疫苗通过高效激发抗原特异性细胞免疫和免疫记忆，实现对肿瘤发生、转移、复发的全方位防控；在已建立的肿瘤模型中展现出显著的治疗效果，且与免疫检查点阻断疗法协同增效。

（五）SORT LNP拓展应用

研究方法

研究团队将其整合到已报道的脾脏靶向 SORT LNP 中，制备SORT MeDZ LNP，以Luc mRNA为报告基因，静脉注射到C57BL/6小鼠体内，通过IVIS成像系统观察脾脏中mRNA表达情况；以OVA mRNA为模型抗原，评估SORT MeDZ LNP激发OVA特异性CD8+ T细胞应答的能力；通过溶血实验验证其内涵体膜破坏能力。

实验结果

SORT MeDZ LNP在脾脏中的蓄积未受显著影响，但mRNA表达效率显著提升；流式细胞术显示，SORT MeDZ LNP组小鼠OVA特异性CD8+ T细胞比例达7.43%，高于SORT LNP组（5.32%）和非pH响应性CB脂质构建的SORT CB LNP组（3.42%）；溶血实验证实SORT MeDZ LNP在内涵体pH下具有更强的膜破坏活性。

小结

MeDZ脂质可与现有靶向递送系统兼容，通过增强内涵体逃逸效率提升 mRNA 表达和免疫激活效果。

小结

本研究针对 mRNA 癌症疫苗递送效率低、反应原性高的核心瓶颈，创新性地设计了膜破坏性两性离子可电离脂质（MeDZ），构建了高效低毒的 mRNA-LNP 递送系统。通过 PyCB 头基的 pH 响应性质子化机制，实现内涵体高效逃逸与 mRNA 高效表达；借助两性离子结构特性，显著降低载体反应原性，实现疗效与安全性的完美平衡。在小鼠黑色素瘤模型中，该系统展现出全面的肿瘤防治效能，且与免疫检查点阻断疗法协同增效，同时兼容现有靶向递送系统，具有广泛的应用前景。

参考文献

[1] Zhao Y, Li R, Liu P, Wang J, Cui Y, Ma Y, Cao Z, Cui M, Luozhong S, Wagner E, Laflin A, Ding Y, Hu Y, Tian Z, Tang C, Cai S, Young H, Liu D, Gu W, Bailey S, Jiang S. Low reactogenicity and high tumour antigen expression from mRNA-LNPs with membrane-destabilizing zwitterionic lipids. Nat Biomed Eng. 2025 Dec 18.

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撰写| RNA星球

校稿| Gddra编审| Hide / Blue sea

编辑 设计| Alice