生物制药中的病毒清除：守护单抗药安全的隐形防线

摘要：单克隆抗体（mAb）这类生物药已成为治疗多种疾病的 “主力军”，但它们依赖哺乳动物细胞生产，容易遭遇内源性或外源性病毒污染，给患者安全带来隐患。病毒清除是生物制药下游加工（DSP）的核心环节，通过色谱法、化学灭活、病毒过滤等多重技术组合，构建起层层递进的安全防线。本文将用通俗的语言拆解这些抗病毒技术，带你了解生物制药如何通过科学设计，让每一支药剂都远离病毒威胁，同时揭秘这项技术的最新进展与未来方向。

一、为什么病毒清除是生物制药的 “必答题”？

生物药和传统化学药不一样，它是 “活细胞造出来的药”。像我们常说的单抗药，大多是通过培养哺乳动物细胞来生产的 —— 这些细胞虽然能高效合成药物，但也可能携带自身的病毒，或者在生产过程中不小心引入外界病毒（也就是“ adventitious 病毒”）。

这些病毒一旦混入药物，后果不堪设想。比如细小病毒、逆转录病毒等，哪怕只有微量存在，都可能让用药患者感染。因此，病毒安全是生物制药的 “生命线”，而下游加工（DSP）阶段的病毒清除，就是守住这条生命线的关键步骤。

根据 2024 年生效的 ICH-Q5A (R2) 指南，所有用动物或人类细胞生产的生物药，都必须通过严格的病毒清除验证，确保每一步工艺都能有效降低病毒载量。而衡量清除效果的核心指标，就是LRV（对数降低值）—— 比如 LRV≥4，就意味着病毒量减少了 1 万倍以上，足以保障用药安全。

二、病毒清除的 “主力军”：色谱法的多重妙用

色谱法是生物制药纯化的核心技术，既能提纯药物有效成分，还能顺带 “筛掉” 病毒，堪称病毒清除的 “多面手”。它就像一个精密的 “分拣系统”，根据病毒和药物分子的物理化学差异，把病毒从药物中分离出来。

1. Protein A 亲和色谱：药物提纯 + 病毒初筛

Protein A 亲和色谱是单抗药提纯的 “黄金标准”，它能精准识别并结合单抗的 Fc 区域，把药物分子从复杂的细胞培养液中 “抓” 出来。在这个过程中，大部分病毒因为无法结合 Protein A，会直接随废液排出，通常能实现 1-4 个 LRV 的清除效果。

不过它的清除效果不够稳定 —— 有些病毒会 “黏上” 单抗分子或色谱树脂，跟着药物一起被洗脱下来。这时候科学家会在洗涤液中加入精氨酸、尿素等添加剂，破坏病毒与药物的相互作用，进一步提升清除效率。

2. 离子交换色谱：精准 “捕获” 带电病毒

离子交换色谱（IEX）分为阳离子交换（CEX）和阴离子交换（AEX）两种，核心原理是利用病毒和树脂的电荷差异来分离。大部分病毒在中性 pH 环境下带负电，所以AEX（阴离子交换色谱）用得更广泛，常以 “流穿模式” 运作 —— 药物分子不结合树脂直接穿过，病毒则被带正电的树脂牢牢吸附。

AEX 对包膜病毒（如 X-MuLV）的清除效果特别好，LRV 能达到 5-6，但对细小病毒（如 MVM）的效果不稳定。研究发现，病毒的表面电荷分布比整体等电点（pI）更影响结合效果，这也让科学家能通过优化 pH 和离子强度，让清除效果更稳定（图 1）。

3. 其他色谱技术：各显神通

疏水相互作用色谱（HIC）：利用病毒表面的疏水性差异分离，包膜病毒因为表面有脂质膜，疏水性更强，更容易被 HIC 树脂吸附，清除效果更优。

混合模式色谱（MMC）：同时利用电荷、疏水、氢键等多种相互作用，适用范围更广，在 pH 4.9-7.5、电导率 5.1-26 mS/cm 的宽范围内都能稳定清除病毒，LRV 可达 5 以上。

三、病毒清除的 “杀手锏”：专门的灭活与过滤技术

如果说色谱法是 “顺带” 清除病毒，那化学灭活和病毒过滤就是针对病毒的 “精准打击”，是构建病毒安全防线的核心步骤。

1. 化学灭活：给病毒 “致命一击”

化学灭活主要针对包膜病毒，通过破坏病毒的脂质包膜让其失去感染性，常用两种方式：

低 pH 灭活：这是最常用的方法，把药物溶液的 pH 调到 3.5-3.8，孵育 30-60 分钟，就能让大部分包膜病毒的 LRV≥5.3。为了防止药物在酸性条件下聚集，会加入精氨酸、极端微生物代谢物（extremolytes）等稳定剂。

溶剂/去污剂（S/D）处理：用 TNBP（磷酸三丁酯）搭配去污剂，1 分钟内就能实现 4-6 个 LRV 的灭活效果。不过传统去污剂 Triton X-100 因环保问题被限制使用，现在正被 OG、LDAO 等更安全的替代品取代。

但这种方法对无包膜病毒（如细小病毒）效果很差，需要其他技术配合。

2. 病毒过滤：最后的 “物理屏障”

病毒过滤是病毒清除的 “最后一道防线”，靠的是 “尺寸筛选”—— 用孔径极细的膜，让药物分子（约 12 nm）通过，而病毒（最小约 18 nm）被牢牢拦住。

这种方法对所有病毒都有效，尤其是难对付的细小病毒，能轻松实现 > 4 个 LRV 的清除。常用的过滤膜有 PVDF、PES、再生纤维素等材质，分为 “直流过滤（DFF）” 和 “切向流过滤（TFF）” 两种模式（表 2）。

不过过滤过程中要注意 “膜污染”—— 如果膜的孔径被杂质堵住，可能会让小病毒 “漏网”。因此，控制过滤流量、提前处理样品，是保证过滤效果的关键。

3. 新兴物理灭活技术：紫外线与臭氧

除了传统方法，科学家还在探索更温和的物理灭活技术：

UV-C 照射：用 254 nm 的紫外线破坏病毒核酸，不影响药物结构，对无包膜病毒的 LRV 可达 4-6，适合作为额外的安全保障。

臭氧处理：利用臭氧的强氧化性破坏病毒包膜和衣壳蛋白，无化学残留，目前还在研发阶段。

四、病毒怎么 “算” 被清除了？检测技术是关键

要证明病毒被有效清除，离不开精准的检测技术。目前主要用 “infectivity 检测 + 分子检测” 的组合方式，确保结果准确可靠。

1.感染率检测：看病毒 “还能不能活”

这类方法直接检测病毒的感染能力，是验证病毒清除效果的 “金标准”：

TCID₅₀测定：将病毒样品稀释后感染细胞，观察细胞病变（CPE），计算能让 50% 细胞感染的病毒浓度（图 2A）。

空斑测定：让病毒在细胞培养皿上形成可见的 “空斑”，通过计数空斑数量确定活病毒浓度（图 2B）。

但这类方法耗时较长，通常需要几天到几周。

2. 分子检测：看病毒 “有没有残留”

qPCR（实时定量 PCR）：检测病毒的核酸，灵敏度极高，几小时就能出结果，能快速判断病毒是否残留（图 2C）。但它会同时检测活病毒和死病毒，不能单独作为感染性判断依据。

NGS（下一代测序）：能同时检测所有病毒的核酸，不管是已知病毒还是未知病毒都能发现，是病毒 surveillance 的 “神器”（图 2D）。

图 1 单抗纯化下游加工（DSP）中病毒清除的主要步骤示意图

图 2 病毒检测的四种主要方法流程图

表 1 病毒清除研究中常用的模型病毒

表 2 病毒去除研究中常用的过滤膜

五、病毒清除技术的 “进化史”：从批次到连续，从树脂到膜

随着生物制药技术的发展，病毒清除工艺也在不断升级，变得更高效、更稳定、更环保。

1.连续加工：让病毒清除 “不中断”

传统的批次工艺是 “一步一停”，而连续下游加工（CDSP）能让捕获、灭活、过滤等步骤无缝衔接。研究证明，连续工艺的病毒清除效果和批次工艺一样好 —— 比如连续 Protein A 捕获、在线低 pH 灭活、长时间病毒过滤，都能实现≥4 个 LRV 的清除效果，还能提高生产效率、降低成本。

2. 膜色谱：比传统树脂更 “能打”

传统的色谱柱用的是树脂颗粒，而膜色谱用的是多孔膜，病毒能更轻松地接触到膜上的功能基团， binding capacity 比树脂高 5-10 倍。而且膜色谱能承受更高的流速，处理效率是树脂柱的 3 倍以上，还能在高离子强度下保持稳定的病毒清除效果，特别适合大规模生产。

3. 活性炭过滤：低成本的 “意外之喜”

谁能想到，平时用来净水的活性炭（AC），在病毒清除中也能发挥大作用。它通过疏水、离子等多种作用吸附病毒，单次过滤就能实现 3-5.8 个 LRV 的清除效果，还能同时去除宿主细胞蛋白、DNA 等杂质。

图 3 采用活性炭（AC）过滤器的无柱单通道过滤法实现的病毒清除效果

注：柱状图展示了三种单克隆抗体制剂（mAb A、mAb B、mAb C）中，AC 过滤器对 MVM 和 X-MuLV 病毒的 LRV 值，包含未处理的加标对照、过滤前加标样品和过滤后产物池的对比数据。

把它和 AEX 膜搭配使用，既能降低成本，又能提升清除效果 ——AC 先吸附大部分病毒和杂质，避免 AEX 膜被污染，后续 AEX 膜再捕获残留病毒，形成 “双重保障”。这种组合工艺不仅效果稳定，还无需昂贵的 Protein A 树脂，是下一代生物制药工艺的潜力选手。

六、未来展望：更安全、更高效的病毒清除之路

生物制药的病毒清除技术，正朝着 “更精准、更灵活、更环保” 的方向发展。未来，我们可能会看到：

定制化的病毒清除方案：根据不同药物的特性，设计专属的色谱 + 灭活 + 过滤组合，让清除效果更优；

更多绿色技术的应用：比如用可降解的去污剂、更环保的过滤膜，减少生产过程中的环境负担；

AI 辅助工艺设计：通过计算机模拟，快速优化 pH、离子强度等参数，缩短工艺开发时间。

说到底，病毒清除技术的每一次进步，都是为了让生物药更安全、更可及。从细胞培养到最终药剂，这层层递进的抗病毒防线，守护的是每一位患者的希望。而我们对这项技术的不断探索，也正是生物制药行业 “以患者为中心” 的最好体现。

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