Nature Communications | 石伟等在新冠病毒刺突蛋白S2′位点切割后的影响研究方面取得进展

2019 年底首次发现的新冠病毒（SARS-CoV-2）引起COVID-19（新型冠状病毒肺炎）大流行，并迅速演变成一场全球性的公共卫生危机。 SARS-CoV-2 是一种单股正链 RNA 病毒，其表面的刺突蛋白（spike，S）负责介导病毒的膜融合，也是疫苗设计的主要靶标。SARS-CoV-2通过其包膜脂质双层与宿主细胞膜发生融合，从而启动对宿主细胞的感染。为克服膜融合过程中存在的显著动力学能垒，S蛋白会从一种亚稳态的融合前构象重折叠为能量更低、更加稳定的融合后构象。S 蛋白在合成后首先在一个蛋白酶切割位点被切成 S1 和 S2 两个亚基；但在膜融合发生之前，推测S蛋白还需要在第二个切割位点（即S2′位点）被一种跨膜丝氨酸蛋白酶TMPRSS2进一步切割，S2′位点的切割对于病毒膜融合和病毒感染入侵非常重要，但其确切的影响机制尚不清楚。

近期，来自哈佛医学院/波士顿儿童医院的Bing Chen课题组（共同一作、共同通讯石伟）在《自然·通讯》（Nature Communications）上在线发表了题为“Effect of the S2′ site cleavage on SARS-CoV-2 spike”的研究论文。该研究报道了S2′位点切割后的 S2 片段的冷冻电镜结构，该结构很可能代表一种晚期膜融合中间态构象；此外，功能实验表明S2′ 位点的切割可增强膜融合过程，其作用机制可能是通过稳定膜融合中间态来实现的。这些研究结果加深了对 SARS-CoV-2入侵宿主细胞机制的理解，并为针对致病性冠状病毒的干预策略提供理论依据。

为评估S2′位点切割对结构的影响，建立了一套制备 S2′ 位点被完全切割的 S2 片段（S2′片段）的方法。在制备 S2′片段时，首先将稳定表达 C 端带有 Strep 标签的全长S蛋白的细胞与可溶性 ACE2蛋白 孵育，随后用胰蛋白酶处理，通过亲和层析进行纯化，获得了完整的 S2′片段。该片段的完整性通过 N 端测序以及 Western blot 检测 C 端标签得以确认。纯化后的S2′片段呈现出类似融合后构象的特征性棒状形态，既可以单个三聚体形式存在，也可以形成由 2 或 3 个三聚体组成的簇状结构。

利用冷冻电镜的方法，解析了分辨率大概为3.1 Å 的S2′片段三聚体结构。该结构类似融合后构象的S2蛋白三聚体，其核心结构由 HR1、HR2、CH 和 3H 螺旋组成（图 1a、1b），与此前报道的融合后S蛋白结构几乎完全一致。S1/S2-S2′小片段在S2′位点切割后已不再与S2其余部分形成共价连接（图 1a），但该小片段仍然与三聚体紧密结合在一起。与此前发表的融合后 S2 结构相比，该结构最显著的差异出现在包含膜相互作用片段的一端——即融合肽和跨膜区（图 1c）。融合肽簇及其邻近结构的局部三重对称轴相对于三聚体其余部分的三重对称轴倾斜约25°。有意思的是，三条 TM 螺旋及其 N 端相邻的HR2片段呈侧向伸展，而不是围绕融合肽簇分布；其中来自三个亚基中两个的S816-834片段进一步稳定了这种侧向伸展。总体而言，该结构表明S2′位点切割并不显著影响融合肽的位置，且S1/S2-S2′片段在切割后不会从三聚体中解离。 此外，还从同一数据以及另一个独立数据中获得了一个低分辨率的结构，显示两个S2′片段三聚体通过其融合肽的疏水相互作用形成二聚体（图 2）。

图1. 新冠病毒刺突蛋白 S2′片段在晚期膜融合中间态构象下的结构

图2. S2′片段通过融合肽的疏水作用形成二聚体的密度图及原子模型

此前，研究人员通过点突变对S蛋白的 S2′切割位点进行了研究，但这些突变对融合前三聚体稳定性的影响并未得到充分讨论。该研究将S蛋白中的Arg815突变为所有其他可能的氨基酸，其中许多替换突变在不影响刺突蛋白表达水平、但会阻断 TMPRSS2 或胰蛋白酶对S2′位点切割的情况下，仍然能够高效支持细胞-细胞融合（图 3a），表明Arg815 有助于稳定融合前构象，但涉及该残基的S2′位点特异性切割并非膜融合所必需，而Arg815的突变都会完全消除 TMPRSS2 介导的膜融合增强效应（图 3b），提示 TMPRSS2 对S2′位点的切割是增强细胞表面膜融合所必需的。当这些突变构建在病毒样颗粒（VLP）体系中进行检测时，TMPRSS2仍然能够增强 VLP 的感染性（图 3c）。其中，多种 S 蛋白突变体（R815F、R815L、R815H、R815Q 和 R815W）能够高效地掺入 VLP，并表现出与野生型S蛋白相当的感染能力（图 3c）。对于其余所有仍具有融合活性的突变体，不论S2′位点或者furin位点二者是否发生突变，其 VLP 感染性均表现出 TMPRSS2 依赖性的增强效应（图 3c）。TMPRSS2 对 VLP 感染性的增强作用可能通过内吞体进入途径实现，并不依赖于S2′位点的切割，与发生在细胞表面的膜融合过程形成鲜明对比。

图3. S2′切割位点突变的影响

本研究加深了对 SARS-CoV-2 膜融合入侵过程的认识，并为防控致病性冠状病毒的干预策略提供理论依据。

哈佛医学院/波士顿儿童医院的Wei Shi（石伟）、GM Jonaid和Md Golam Kibria为本文共同第一作者。哈佛医学院/波士顿儿童医院的Bing Chen和Wei Shi（石伟）为本文共同通讯作者。

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