MTT实验的紫色谜团：你的Formazan真的完全溶解了吗？

在进行MTT实验读取数据时，你是否遇到过复孔间差异巨大、或同一块板在不同时间读数结果飘忽不定的情况？这很可能不是细胞行为的问题，而是实验最后一个关键步骤——甲臜（Formazan）结晶溶解——出了差错。许多人认为加入二甲基亚砜（DMSO）摇晃即可，实则不然，溶解的完全与否与均一性，直接决定了数据的可靠度。

Formazan晶体是一种高度疏水性的物质。它形成于细胞内的线粒体周围，其颗粒大小和聚集状态因细胞类型、数量及代谢活性而异。单纯依靠DMSO的溶解能力，有时难以快速、彻底地瓦解这些紧密的晶体聚集体，尤其是当细胞密度较高时。未被完全溶解的微小晶体颗粒悬浮在溶液中，会导致吸光度读数不稳定，短时间内读数持续上升，造成“数据在仪器里还在生长”的假象。

溶解不完全的核心在于未能有效克服晶体疏水性与溶剂之间的界面张力。普通过程中，移液器吹打混匀的物理力度往往不足。一些改良方案采用酸化十二烷基硫酸钠（SDS）溶液作为溶解剂。SDS作为一种离子型表面活性剂，能显著降低界面张力，其酸性环境（通常pH调至4.7）也有助于甲臜产物的稳定溶解。使用SDS溶液通常能得到更澄清、稳定的紫色溶液，数据重现性更高。

另一个常被忽略的细节是残留培养基的影响。在弃旧培养基加入溶解剂前，尽量吸净孔内液体是关键一步。残留的少量培养基，特别是其中的血清蛋白，会与部分甲臜结晶结合或干扰溶解剂的作用，导致孔间本底差异。对于贴壁不牢固的细胞，弃液过程需要谨慎，避免细胞脱落。有时，先用磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔清洗一次，再进行溶解操作，能获得更干净的背景。

在追求数据稳定性的实验中，溶解剂的配方至关重要。例如，Abbkine的MTT细胞增殖与毒性检测试剂盒所提供的溶解液，即采用了优化配比的表面活性剂与缓冲体系。这种预混的配方旨在加速结晶溶解并确保数小时内溶液的稳定性，尤其有助于提升高通量实验的效率和数据一致性。溶解后的均一化步骤同样重要。将溶解剂加入孔板后，推荐使用平板振荡器在低速下持续振荡10至15分钟，确保晶体彻底分散溶解。在上机读数前，检查孔板底部是否有细微的紫色颗粒或斑驳状附着。