siRNA转染实验指南之siRNA设计与合成

小干扰RNA（siRNA）是一种短双链RNA分子，通常由21-25个核苷酸组成。其作用机制是通过与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合，引导特定mRNA的降解，从而实现靶向基因表达的抑制或敲降，这一过程也称为RNA干扰（RNAi）或基因沉默。

siRNA转染正是利用这类小RNA分子靶向并沉默特定基因的技术。该技术通过将siRNA瞬时导入细胞，依托RNAi机制降低目标基因的表达，目前已广泛应用于基因功能研究与疾病防治等领域。在此过程中，siRNA的设计与合成是关键环节。大多数研究者会选择由合成生物公司进行设计，这对技术人员的专业能力与经验提出了较高要求，也有很大部分研究者通过自行设计使用siRNA合成试剂盒来进行siRNA制备。总之，合理有效的siRNA设计不仅能提升转染效率，还能获得更理想的基因敲低效果。下文将对此展开详细介绍。

一：siRNA设计合成的原则

关于siRNA的设计与合成，其关键在于实现高度的靶标特异性，这对于siRNA转染实验来说可谓是至关重要的。不合理的序列设计可能导致siRNA与靶基因的结合亲和力降低，即所谓的“脱靶效应”或者引发潜在的非特异性基因沉默，从而影响转染效率。此外，siRNA序列中的GC含量也会对转染效率产生影响。一般来说，GC含量适中（约40%-60%）的siRNA转染效率相对较高，GC含量过高或过低都可能影响siRNA的稳定性和与细胞内相关蛋白的相互作用，进而降低转染效果。

二：siRNA化学合成

由生物公司设计合成的siRNA，一般都是采用化学合成的方法。为了提高siRNA的特异性和转染效率，专业的生物合成公司，如百代生物、赛索飞、吉玛等等，在进行siRNA设计时会多方位考虑各个因素，包括与潜在脱靶位点的不匹配程度、种子区域的互补性、GC含量以及其他可能带来负面影响的序列特征，以保证能够更加精准的识别目的基因的mRNA并对其进行敲降。

对于初次进行siRNA转染实验的研究者来说，最好选择定制siRNA的三保一套餐，即其中会包含三条目的基因siRNA序列，合成公司会保证至少有一条siRNA序列对目的基因mRNA具有显著的降解作用；此外，套餐中还包含阴性对照、阳性对照以及带荧光标记的阴性对照，方便研究者进行不同的实验设计与验证，可以说非常有用！

三：siRNA酶促合成

除此以外，也有很多研究者考虑到找公司合成siRNA实验成本较高、等待周期较长，进而选择siRNA合成试剂盒自行合成，目前市面上这样的试剂盒并不多见，常用的试剂盒有BIOG等。这类试剂盒主要是通过酶促合成法来制备siRNA的，具体而言是利用T7 RNA聚合酶，以单链DNA寡核苷酸为模板，在体外大量转录合成出所需序列的单链RNA，再将两条互补的单链RNA退火形成双链的siRNA。与传统化学合成法相比，siRNA合成试剂盒具有以下几方面的优势：1）更低的实验成本，平均1 OD siRNA仅需50元，而生物公司合成价格约为180元/OD上下；2）siRNA合成自由度上有极大提升，找公司合成固然很省力，但从沟通到交付短则四五天，长则两周，研究者实验时间安排非常受限，而使用试剂盒可以随时进行siRNA合成，时间安排自由；并且像BIOG这种试剂盒中使用的是经基因工程改造后的T7 RNA聚合酶，单次反应产量最高可达200ug（约5OD），合成量上也能实现自由最大化；3）研究者个人科研能力可以得到极大提高，所谓“技多不压身”，siRNA合成试剂盒可以手把手教会研究者如何设计siRNA序列、如何设计Oligo DNA模板、如何利用T7 RNA聚合酶合成出高产高纯的siRNA等等，对于实验者本人的个人实验能力和思考能力都有很大提升。对于以下应用场景siRNA合成试剂盒都是非常合适的：当发现某条siRNA序列在预实验中表现出优异的沉默效果后，可立即使用该试剂盒进行放大合成，快速获得足量材料以供后续深入研究；亦或是在探索新靶点时，能够随时设计并合成多条候选序列进行快速筛选，加速研究进程。

最后，无论选择委托专业公司合成还是尝试自行合成，研究者在获得siRNA后，都需要在正式实验前对其转染条件进行优化，以获得最佳的基因沉默效果。转染试剂的选择、细胞密度、siRNA浓度及转染时间等因素都会影响最终的敲降效率，建议通过预实验进行系统摸索。