NAR | 中国农业大学赖锦盛教授团队开发出新型基因编辑剪刀——CRISPR-Casδ系统

近日，中国农业大学农学院赖锦盛教授团队在国际顶尖学术期刊Nucleic Acids Research上发表重要研究成果，题为Casδ, an evolutionary transitional CRISPR system enables efficient genome editing across animals and plants。该研究从海量微生物数据中鉴定出一个全新的CRISPR效应蛋白家族Casδ。该系统体积小巧、仅需单链crRNA引导，更在动植物基因组编辑中展现出高效、广谱的应用潜力。

在基因编辑领域，CRISPR-Cas12系统因其多样性和应用潜力备受瞩目。然而，当前主流工具如SpCas9或Cas12a体积庞大、PAM限制严格，而众多新发现的小型Cas系统（如Cas12f）往往编辑效率较低或需要复杂的双RNA引导机制，限制了其在动植物育种及基因治疗中的应用。针对这一瓶颈，研究团队将目光投向了蕴藏着巨大微生物多样性的宏基因组数据，对超过14.7亿个蛋白质序列进行筛查，鉴定到一个全新的蛋白家族Casδ (Delta)。Casδ 与所有已知的Cas12亚型（如Cas12a, b, f, n等）均保持显著的进化距离，被定义为一个全新的Cas12家族。该家族包含三个同源蛋白（Casδ-1, Casδ-2, Casδ-3），其蛋白大小仅为867-936个氨基酸，比Cas12a和Cas12i分别缩小约24%和10%，属于紧凑型编辑工具。

经过生化表征，Casδ-1展现出一系列优异特性。与需要crRNA和tracrRNA双重引导的Cas9或Cas12f不同，Casδ-1仅需一条成熟的crRNA即可完成DNA识别与切割。Casδ-1特异性识别 5’-RYR-3’（R=A/G, Y=T/C）PAM序列。与多数Cas12偏好T-rich PAM不同，这种偏向嘌呤（A/G）的PAM极大地扩展了基因组靶向范围。

图1 CRISPR-Casδ核酸酶的鉴定

研究团队在多个层面验证了Casδ-1的实际编辑能力，在HeLa细胞的多个内源性基因位点（如AAVS1、HPRT）上，Casδ-1均实现了高效切割，并产生以长片段缺失（>20bp）为主的编辑结果。脱靶分析显示，在预测的潜在脱靶位点未检测到编辑活性，表明其具有高特异性。

图2 Casδ-1实现人类细胞多基因位点高效编辑

团队将Casδ-1成功应用于玉米和水稻的稳定遗传转化。在玉米中靶向ZmGL2基因，编辑效率达到20%，T1代阳性植株表现出预期的叶片蜡质缺失表型。在水稻中靶向OsPDS基因，编辑效率达到13.3%，基因缺失型突变体表现为白化表型。这充分证明了Casδ-1在单子叶植物中具有强大的内源基因编辑能力，为作物基因编辑育种提供了新工具。

图3 Casδ-1系统在植物基因组编辑中的应用

Casδ-1的预测蛋白结构显示，它同时保留了祖先蛋白TnpB/Cas12n特有的C末端结构域，以及成熟Cas12b中出现的、被RuvC域分割的NUC结构域。研究团队猜想Casδ可能处于进化路径的中间点：它已像成熟系统（如Cas12a）一样，摆脱了对tracrRNA的依赖，仅用crRNA引导；但其C末端结构域尚未完全进化，仍对活性有关键作用。基于此，团队提出了一个基于Casδ的三阶段V型CRISPR系统进化模型：

• 阶段I（原始过渡）：从依赖长链ωRNA的TnpB，进化到仍需双RNA（crRNA/tracrRNA）引导的Cas12n。

• 阶段II（功能替代）：Casδ作为关键过渡形态出现，实现了从双RNA到单crRNA引导的决定性转变。

• 阶段III（系统成熟）：整合适应模块，形成功能完备的Cas12a、Cas12b等成熟系统。

Casδ的发现如同古生物学中发现了连接鱼类与陆生动物的“提塔利克鱼”，证明了CRISPR从简单到复杂的进化路径。

图4 Casδ-1与其他 Cas12 核酸酶的结构比较与进化分析

中国农业大学玉米生物育种全国重点实验室赖锦盛教授、辛蓓蓓副教授、陈建副教授为该论文的共同通讯作者。杨志佳副研究员、博士生余镁霞、李沛洋和博士后李卓洋为论文共同第一作者。宋伟彬教授、赵海铭教授、赵海楠教授和卞超青年研究员对该工作提供了重要的指导和帮助。该研究工作得到了农业农村部项目、国家科技部重点研发计划、拼多多-中国农业大学研究基金的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkaf1358