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“一个令人困惑的现象：同一个化合物，在MTT法中显示微弱活性，换用其他方法验证却表现显著。问题有时并非细胞耐药，而可能隐藏在MTT实验最后一步——紫色结晶的溶解环节。”
1. MTT结晶的溶解：并非瞬间完成
MTT被细胞线粒体还原后形成的紫色Formazan结晶是疏水性的，需要加入有机溶剂（如DMSO）溶解后才能进行吸光度检测。溶解不充分是导致数据偏差的常见根源。
- 溶解需要时间与均一化：简单地加入DMSO后静置10-30分钟，可能不足以完全溶解孔底尤其是边缘的结晶。我们观察发现，轻柔的振荡混匀能极大促进溶解的完全与均一。使用平板振荡器并优化振荡时间（例如，37℃、低速振荡10-15分钟），通常比静置效果更佳、更稳定。
- 避免过度溶解：同时，也需注意溶解时间不宜过长，以防DMSO挥发或产生其他副反应影响读数稳定性，通常建议在完全溶解后尽快检测。
2. 背景信号的“隐形干扰者”
- 血清与酚红：溶解Formazan时，原有的培养基（特别是含酚红的培养基）会混入有机溶剂，增加背景吸光度。因此，必须设置仅含“培养基+MTT+溶解液”的对照孔，以扣除该背景值。不同批次血清的颜色和成分差异也会对此背景值产生影响。
- 细胞裂解液的影响：若使用裂解液（如SDS）进行溶解，需注意其浓度和溶解时间的优化，以确保Formazan完全溶解且不形成干扰。
3. 一个值得深思的对比
有文献报道及实验室经验表明，由于MTT法涉及结晶溶解步骤，其操作变异性有时高于CCK-8等直接水溶性四唑盐方法。在遇到难以解释的数据差异时，考虑使用另一种原理的细胞活力检测方法进行交叉验证，是判断结果可靠性的有效策略。
4. MTT实验的稳健性指南
- 必须设置正确的对照：包括培养基背景对照、未加药细胞对照（100%活力）、以及可能的最大裂解对照。
- 确保完全溶解与混匀：在读数前，务必肉眼或显微镜下检查孔内无未溶解的紫色颗粒，并确保溶液均一。
- 注意读数时间：完全溶解后，建议在1小时内完成读数，避免放置过久导致吸光度变化。
声明：内容由AI生成
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