Dev Cell | 孙京波等开发新型筛选平台鉴定出多种纤毛调控因子

基于 CRISPR/Cas9 的全基因组系统性基因扰动筛选，使研究者能够在更广阔的尺度和更高的分辨率下解析基因功能 ， 给 功能基因组学研究带来了深刻变革。 目前广泛应用的 Pooled-CRISPR 筛选，通过将靶向特定基因或全基因组的 sgRNA 文库导入细胞，构建包含大量不同基因突变的细胞群体。随后，研究者可以基于细胞存活率、增殖速度、药物敏感性以及流式细胞分选结合荧光报告基因等易于量化的表型变化，对具有特定表型的细胞群体进行富集和筛选，从而鉴定出调控 相关 表型的关键基因【1,2】。

尽管这类 Pooled-CRISPR 筛选方法在高通量、成本效益和实验可扩展性方面具有显著优势，但其在解析更 加 复杂 和 精细的细胞特征方面仍然受到限制。例如，与细胞器形态变化、亚细胞蛋白定位、细胞骨架动态重塑等需要通过显微镜观察分析的表型相关的基因，常常难以通过传统的 Pooled-CRISPR 筛选直接捕获。将 Pooled-CRISPR 筛选与显微成像技术相结合在实验设计、数据分析、成像通量等方面都面临显著挑战。如何在保持大规模筛选能力的同时，提高成像解析度和表型分类能力，是当前 CRISPR 功能基因组学向更深层次拓展时亟需解决的问题。

针对上述局限， 近日， 耶鲁大学David Breslow团队 （ 第一作者为孙京波 ） 在Developmental Cell上发表了文章A microscopy-based CRISPR screening platform enables organellar functional genomics and illuminates ciliary biology，开发了一种新型筛选平台，将pooled-CRISPR 基因扰动与荧光显微镜表型分析相结合。该平台利用商业化的显微镜硬件与软件与基于定向光激活mCherry蛋白的pooled-CRISPR筛选策略相结合，通过对呈现特定表型的突变体细胞进行光激活，使其能够借助流式细胞仪（FACS）实现高效分选（图1）。这一策略不仅实现了对复杂显微表型的可扩展筛选，也避免了对光学或编程方面的专业背景依赖，使平台具备良好的可及性。 为了进一步提升实验灵活性并拓宽可筛选表型的范围，该团队建立了两种互补的工作模式：（ 1 ）通过在活细胞中进行遗传筛选，可对细胞内动态过程进行时空分辨分析；（ 2 ）在固定细胞中结合抗体免疫标记进行筛选，从而拓展其在多种细胞结构和分子标志物中的适用性。这一设计使得平台兼容活细胞及固定细胞分析，并能够处理多种类型的细胞特征 。

基于这一自动化、高通量且可扩展的筛选 平台 ，该团队成功开展了全基因组和靶向性筛选，鉴定出多种已知及全新的纤毛调控因子【3】。进一步，通过整合平行筛选结果，构建了多维度的功能特征图谱， 实现了对基因功能的精确映射 。通过对筛选获得的候选基因 的 深入研究，该团队鉴定了调控纤毛 G 蛋白偶联受体（ GPCR ）功能的关键因 子 EMC 复合体 ，该复合体 能够特异性调控纤毛 GPCR (HTR6) 的定位，而不影响纤毛发生 （ ciliogenesis ） ，这一功能在 EMC5 和 EMC6 敲除细胞中得到了验证； 并 确认了二吡啶酰胺化赖氨酸（ diphthamide ）生物合成通路在纤毛解体中的作用 。同时该团队还鉴定出 一种位于纤毛过渡区（transition zone, TZ）、对纤毛发生至关重要且具有进化保守性的微 型 蛋白SMIM27 ， 进一步的研究表明， SMIM27/ TZMP1 定位于纤毛过渡区（ transition zone ），并且 SMIM27/TZMP1 对人 体 细胞的纤毛形成及非洲爪蟾 （ Xenopus ） 胚胎纤毛功能的正常发挥均必不可少。

总体而言，该论文提供了一个功能强大、可广泛应用的技术与概念框架，证明基于显微镜的CRISPR筛选能够系统性地将基因与细胞器表型关联，并揭示新的生物学功能(图2)【4】。 这些发现不仅深化了我们对纤毛结构与功能调控机制的理解，也为纤毛疾病的治疗提供了新的潜在解决途径。

https://www.cell.com/developmental-cell/fulltext/S1534-5807(25)00666-5

制版人： 十一

参考文献

1 Schraivogel, D., Steinmetz, L. M. & Parts, L. Pooled genome-scale CRISPR screens in single cells.

2 Shalem, O., Sanjana, N. E. & Zhang, F. High-throughput functional genomics using CRISPR–Cas9.Nature Reviews Genetics16, 299-311 (2015).

3 Breslow, D. K. et al. A CRISPR-based screen for Hedgehog signaling provides insights into ciliary function and ciliopathies.Nat Genet50, 460-471 (2018).

4 Sun, J., Atiş, I. S., Empke, S. L., Khokha, M. K. & Breslow, D. K. A microscopy-based CRISPR screening platform enables organellar functional genomics and illuminates ciliary biology.Dev. Cell(2025).

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