横川旋转盘

　　介绍

　　生物成像存在两个传统荧光显微镜无法克服的重要挑战。首先，生物标本是三维结构，为了全面理解它们，我们常常需要构建三维图像。其次，许多生物学家希望研究的过程发生在生物结构内部，但细胞膜等其他细胞特征阻挡了清晰的视野。

　　由于需要通过整个样品以照亮所选成像平面，这些问题难以克服。这几乎无法控制回射光线的来源。来自模糊平面或目标平面上下明亮特征的光线无法用传统荧光显微镜阻挡。

　　共焦显微镜为这个问题提供了解决方案。共焦显微镜利用光学切片，从样品中取多片薄片，构建三维模型。这一过程消除了来自其他平面的失焦光线。共軛軛显微镜的第一个设计是激光扫描共軛焦显微镜(LSCM)，但随后又推出了旋转盘共軛軛焦显微镜(SDCM)，详见下文章节。

　　激光扫描共焦点显微镜

　　LSCM采用激光光源，光束通过激发光路径中的针孔，而样品被照点的发射光通过另一个针孔进入探测器，如图1所示。

　　图1：共轭成像平面中的针孔孔阻挡了失焦光线。样品内部的红色虚线(灰色方块)显示所需的成像平面，同时显示透镜(平面圆)和探测器(同心圆)。第一张图片显示了没有光路的装置。第二张图显示样品上方的光(被针孔阻挡)，第三张从样品下方(被针孔阻挡)的光，最后一张显示来自目标样品平面的光(未被针孔阻挡，已检测到)。

　　为了生成图像，激发激光器在样品中X和Y方向进行光栅扫描，然后从探测到的光线重建图像。在Z方向成像和生成三维图像时，需要可移动的Z级。该技术能生成高质量图像，但每张图像仅需1秒，是非常慢的成像速度。此外，LSCM仅限于低效率光电倍增管作为探测器，且由于使用缓慢且高浓度激光，活样品容易遭受大量光漂白/光损伤。因此，活细胞工作或快速过程成像需要另一种技术。

　　旋转盘共焦点显微镜

　　SDCM通过使用多个针孔扫描整个图像，实现过程并行化，大幅提升采集速度，解决了LSCM问题的问题。与LSCM相比，SDCM速度快、灵敏且实现简单。这使得它成为研究三维结构、快速动态过程、长期延时或细胞膜内部细节的良好选择，这些都可能用于活细胞。最先进的旋转盘设计由日本横川电力公司设计，至今仍是显微镜制造商的“黄金标准”。

　　横川旋转盘

　　横川旋转盘单元由两个同轴排列的盘组成：集电盘和针孔盘，中间设有二色镜。每个圆盘内含有排列成一系列嵌套螺旋的针孔。集光盘上的针孔内含有菲涅尔微透镜，将光聚焦到针孔盘上，因为两个圆盘是共对齐的。针孔位于微透镜的焦平面，如图2所示。

　　图2：展示横川SDCM原理和光学组件的示意图。集电盘包含与针孔盘内针孔图案对齐的微透镜图案。这些圆盘固定在电动机轴上，它们之间的距离等于微透镜的焦距。旋转圆盘会使一组聚焦激光束在样品上扫描。沿照明路径返回的聚焦荧光发射比例优先通过针孔阵列，并由位于两盘之间的二色镜反射到相机端口。图片来源：Nelson等人(2010)。

　　激光激发从上方引入，并通过准直透镜投射到集电盘上。光线穿过微透镜和二色镜，照射到针孔盘上的针孔区域。当盘片旋转时，针孔会依次扫描整排图像。这些针孔的位置使得每旋转30°时扫描图像的每一部分。因此，盘的转速决定了最大图像采集速度。

　　样品的荧光发射被物镜收集，并聚焦回针孔盘。针孔阻挡了失焦光线通过盘面，因此来自一个针孔的照明光会产生发射光，并被同一针孔收集。这些光被二色镜反射，经过发射滤镜后聚焦到相机传感器进行检测。

　　旋转盘显微术本质上是一种光线抑制技术，因此高光子预算对于高质量成像是必要的。因此，横川旋转盘单元采用光束整形、准直透镜和微透镜，大幅增加光通量，提高光子收集效率。此外，针孔图案确保图像帧均匀照明，因此视场中没有光强梯度，也没有扫描条纹。

　　横川纺盘的类型

　　目前横川纺盘单元主要有两种类型：CSU-X1和CSU-W1。作方式相同，但两者之间存在重要差异：

　　1.CSU-X1：速度更快的单元，扫描速度最高可达10,000转/分钟(理论最大采集速度2000英尺/秒)

　　2.CSU-W1：扫描速度较低，最高可达4000转/分钟(理论最大采集速度200 fps)，但视场面积几乎扩大了4倍，以便更好地适应如新型先进CMOS设备的大视场相机传感器。它还具有减少串扰和更广近红外光谱范围的特点，使得对活细胞内部更深区域的成像更加清晰。

　　历史上，还有另外两种型号，CSU-10和CSU-22，分别在转速为1800转/分钟(最高260 fps)和5000转/分钟(最高1000 fps)上有所不同。这些单位型号已停止生产，但仍有大量仍在使用中。

　　在使用横川旋转盘进行快速成像时，盘片旋转速度必须调整以匹配相机曝光时间。每针孔盘旋转30°，扫描图像的每个区域，因此相机的曝光时间必须是完成一次30°旋转所需时间的整数倍。如果曝光时间与扫描速度不匹配，条纹图案可能会叠加在图像上。在使用长曝光时间(~100毫秒)时，这点不太重要，但如果需要以200 fps(5毫秒曝光)及以上拍摄，则会成为问题。

　　第二个相机接口常用于横川旋转盘片单元，以实现同时进行双色成像，或者历史上，一个端口配备EMCCD用于低信号成像，另一个端口配备CMOS摄像头以获得更大的视野和更高速度的成像。然而，随着高灵敏度背光sCMOS设备的出现，这两项功能现在可以用一台相机完成。

　　宽视场技术成像与共聚焦技术的示例可见图3。

　　图3：广角图像与共聚焦图像。(A)广视场图像，(B)约20微米厚小鼠肾脏切片的共聚焦图像。(C)宽视场图像和(D)约50微米厚乳腺上皮细胞的共焦图像。比例杆 20 微米。改编自Jonkman和Brown(2015年)。

　　横川旋转盘的相机

　　任何相机都可以搭配横川旋转盘机使用，但最佳性能适合高速且视野宽的灵敏相机

　　现代sCMOS相机因其大视野、高速和多样像素尺寸以最大化分辨率而被用于SDCM——6.5微米像素尺寸保证60倍放大的奈奎斯特采样，11微米像素尺寸保证100倍放大的奈奎斯特采样。

　　背光式sCMOS相机还具备与EMCCD相机相当的灵敏度，同时具备sCMOS技术在视场、速度和像素尺寸上的优势。这使得灵敏度最大化，而无需在速度或视场之间做出权衡，确保数据采集更快、更具生理意义。

　　横川旋转盘系统是旋转盘共聚焦显微镜的重要组成部分，实现高速多通道成像，低光毒性，改进了以往激光扫描共焦技术。将此类系统与强大且灵敏的sCMOS相机结合，可以实现活细胞及其他样本的快速、灵活成像。