Immunity | 细胞特异性顺式调控元件和转录因子环路决定FOXP3表达

撰文 | 风

谱系决定因子由顺式调控元件（cis-regulatory elements，CREs）紧密调节以确保其细胞特异性表达。这些谱系转录因子基因常常具有包括多个CREs的超级增强子，通过与相应的转录因子（Transcription factor，TF）和反式调控因子（trans-regulatory factors）作用，整合来自细胞内外多种信号，从而实现对基因表达的时空精确控制【1】。虽然染色质图谱研究可以提供候选CREs-TF的快照，但非编码序列和TF相关的综合扰动性研究对于确定关键调控因子至关重要。考虑到免疫细胞的可塑性和异质性以及功能上的差异性，这样的研究在免疫细胞中尤其重要。

CD4 T细胞是适应性免疫应答的重要构成细胞，可大致分为促炎的传统T细胞（conventional T cell，Tcon）和抗炎的调节性T细胞（regulatory T cell，Tregs）。其中，Foxp3是Treg的关键转录因子和标志物。尽管小鼠中Foxp3只表达在Treg，研究表明在人体内Foxp3不仅在Treg构成性表达，也可以短暂表达在Tcon并具有调控活化的功能【2,3】。目前小鼠中已经鉴定到多个调节Foxp3表达CREs。4个保守非编码序列（conserved non-coding sequence，CNS）作为增强子分布在其基因附近，包括CNS0-3。CNS0位于Foxp3启动子上游，在胸腺Treg发育中调节IL-2诱导的Foxp3表达【4】；CNS1和CNS2位于Foxp3第一个内含子中，CNS1促进外周诱导型Treg分化和Foxp3的表达，CNS2维持Foxp3基因的长期、稳定表达和继承【5】；CNS3位于Foxp3第2个内含子，负责Foxp3在胸腺和外周Treg发育中Foxp3的重新表达【5】。尽管如此，在人Treg中以及人Tcon中短暂表达的Foxp3的CREs和TF仍缺乏系统性研究。

近日，美国格莱斯顿-加州大学旧金山分校基因组免疫学研究所Alexander Marson团队在Immunity上发表了题为FOXP3 expression depends on cell-type-specific cis-regulatory elements and transcription factor circuitry的研究文章。该研究使用CRISPR首次在人Treg和Tcon建立FOXP3表达的CRE-TFs调节环路，并鉴定到CNS0和NS-序列分别是Tcon中FOXP3表达的正向和负向CRE，进一步深化对FOXP3表达的理解，为精确靶向Treg治疗炎症性疾病提供新的策略。

为了系统性评估人原代Treg和Tcon中FOXP3的CREs，团队设计CRISPRi tiling screen策略在FOXP3的转录起始位点（TSS）上游85kb至下游39kb范围内逐一敲除基因片段，随后再刺激48小时诱导FOXP3表达，通过流式分选分析FOXP3的表达状态（分布两端的25%分别为低表达或高表达）。因此，Foxp3低表达组的gRNAs负责正向调节FOXP3表达而Foxp3高表达组的gRNAs则为负向调节FOXP3表达。结果证实在人Treg中，TSS最为影响FOXP3表达。此外，多个正向调节FOXP3表达的gRNAs富集在最开始的8kb片段内，包括CNS1、CNS2和CNS3。不同于小鼠成熟Treg，团队发现人Treg需要CNS0维持Foxp3表达。不仅如此，作者鉴定到距离Foxp3的TSS上游1.1kb，在小鼠中称为Flicr的lncRNA负向调节FOXP3的表达。相比于Treg，CNS1、CNS2和CNS3在Tcon中似乎并不是FOXP3表达所必须。相反，TSS和CNS0对于Tcon中FOXP3的表达至关重要。意外的是，在TSS上游11.8kb长度为2kb的非编码序列（positive non-coding sequence，NS+）在Tcon中促进FOXP3表达。随后，作者使用正交CRISPR删除策略在静息和激活Treg和Tcon中敲除FOXP3的TSS、FLICR、CNS0和NS+，进一步证实在静息和激活Treg中TSS和CNS0促进而FLICR抑制FOXP3表达，在激活尤其是静息Tcon中TSS、CNS0和NS+促进FOXP3表达。值得注意的是，敲除临近基因PPP1R3F的启动子和TSS区域而非PPP1R3F引起Tcon细胞FOXP3表达显著增加，表明临近PPP1R3F的启动子的非编码序列调节FOXP3表达，作者将其称为NS-。总之，上述结果表明在人Treg，CNS0-3促进而FLICR抑制FOXP3表达；在人Tcon，CNS0和NS+促进而NS-抑制FOXP3表达。紧接着，作者使用ATAC-seq、CHIP-seq和甲基化检测证实CNS0、NS+和NS-具有CREs的性质，即存在相匹配的组蛋白乙酰化、DNA甲基化和染色质可即性。随后，团队使用CRISPRoff技术在Tcon中研究CNS0、NS+和NS-位点表观沉默的功能效应。亚硫酸盐测序证实CRISPRoff特异性在CNS0、NS+和NS-位点而非CNS2等位点维持高甲基化。CRISPRoff靶向CNS0和NS+均抑制Tcon中FOPX3的诱导表达，而靶向NS-则促进FOXP3的表达。有意思的是，同时靶向CNS0、NS+和NS-则几乎废除FOXP3的表达，表明沉默NS-诱导FOXP3表达需要CNS0和NS+处于激活状态。

为了寻找FOXP3重要的转录因子，作者使用类似的CRIPSR筛选策略。在Treg中，除了小鼠中确认的TF，如CBFB、GATA3、ATXN7L3、USP22和 STAT5A，还发现FOXP3的表达依赖中介体复合物如MED11、MED12、MED14和MED33，而SATB1和SRF抑制FOXP3表达。另外，分析鉴定YBX1也是FOXP3的负调节因子，这在小鼠研究中没有报道。在Tcon中，一部分正向TF与Treg共享，包括GATA3、 STAT5A/STAT5B和ATXN7L3；负向TF包括甲基化相关因子（DNMT1和MBD2）、和Treg共享因子（YBX1、SATB1和EGR2）以及独特存在于Tcon如TFDP1和ETS1。随后的敲除实验证实这些正向和负向TF在Treg和Tcon中的调控作用。紧接着，作者使用CHIP验证这些TFs是否直接结合在FOXP3的CREs。在Treg中，正向TFs主要结合正向调节CREs，例如STAT5结合在CNS0和CNS2，HIC1结合在TSS和NS+。负向TFs也存在于正向调节CREs，例如SATB1结合在TSS、CNS0和CNS2，提示增强子存在正负调节TFs的平衡。类似地，在Tcon中，正向TFs如GATA3、STAT5B和BCL11B结合在CNS0， STAT5B也能结合在NS+；负向TFs如SATB1、EGR2和MBD2也能结合在CNS0。与此同时，团队也筛选到负向NS-位点可以结合负向TFs如EGR2、ETS1、DNMT1、TFDP1和MBD2，也能结合正向TFs如BCL11B和YY1，再次表明CRE中正负TFs的平衡。随后，TFs敲除结合ATAC-seq分析发现GATA3和STAT5的敲除分别明显降低CNS0和NS+位点的染色质可即性。总之，这些数据表明多种顺式调节因子结合在CNS0、NS+和NS-等CREs调节染色质可即性控制FOXP3表达。

最后，作者试图揭示人和小鼠Tcon中FOXP3表达的差异机制。首先，作者假设NS+由于在人和鼠中只有部分保守而允许人Tcon表达FOXP3。然而，作者发现小鼠CNS0和NS+具有与人类似的增强子活性，也存在正向TFs的结合，提示CNS0和NS+区域的染色质活性并不足以诱导Foxp3表达。随后，作者假设NS-在小鼠也能抑制Foxp3表达且比人活性更强。预测分析发现相比于人，小鼠NS-序列与EGR2、TFDP1和E2F3的亲和力更强，提示NS-是小鼠Tcon细胞Foxp3表达的强力抑制CRE。为此，作者使用CRISPR技术在小鼠Tcon中敲除NS序列确实诱导Foxp3的表达。此外，没有单一的TFs敲除可以诱导小鼠Tcon表达Foxp3，提示TFs可能存在冗余。然而，EGR2突变则可以诱导Foxp3表达，但强度不如NS-序列敲除明显。总之，这些数据表明小鼠NS-序列同样抑制Foxp3表达。

综上所述，这项研究通过CRISPR筛选在人Treg和Tcon构建FOXP3表达的特异性CREs和TFs调控环路，在人Treg，CNS0-3促进而FLICR抑制FOXP3表达，在人Tcon，CNS0和NS+促进而NS-抑制FOXP3表达。此外，该研究揭示NS-与TFs的亲和力不同是人和鼠Tcon中Foxp3表达差异的原因。总之，该研究不仅促进对FOXP3表达的理解，也为靶向Treg的疾病治疗提供新的思考。

https://doi.org/10.1016/j.immuni.2025.10.020

制版人： 十一

参考文献

1. François, Spitz., Eileen E M, Furlong.(2012). Transcription factors: from enhancer binding to developmental control.Nat Rev Genet, 13(9), 613-26. doi:10.1038/nrg3207

2. Jun, Wang., Andreea, Ioan-Facsinay., Ellen I H, van der Voort., Tom W J, Huizinga., René E M, Toes.(2006). Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells.Eur J Immunol, 37(1), 129-38. doi:10.1002/eji.200636435

3. Marc A, Gavin., Troy R, Torgerson., Evan, Houston., Paul, DeRoos., William Y, Ho., Asbjørg, Stray-Pedersen., Elizabeth L, Ocheltree., Philip D, Greenberg., Hans D, Ochs., Alexander Y, Rudensky.(2006). Single-cell analysis of normal and FOXP3-mutant human T cells: FOXP3 expression without regulatory T cell development.Proc Natl Acad Sci U S A, 103(17), 6659-64. doi:10.1073/pnas.0509484103

4. Ryoji, Kawakami., Yohko, Kitagawa., Kelvin Y, Chen., Masaya, Arai., Daiya, Ohara., Yamami, et al.(2021). Distinct Foxp3 enhancer elements coordinate development, maintenance, and function of regulatory T cells.Immunity, 54(5), 947-961.e8. doi:10.1016/j.immuni.2021.04.005

5. Ye, Zheng., Steven, Josefowicz., Ashutosh, Chaudhry., Xiao P, Peng., Katherine, Forbush., Alexander Y, Rudensky.(2010). Role of conserved non-coding DNA elements in the Foxp3 gene in regulatory T-cell fate.Nature, 463(7282), 808-12. doi:10.1038/nature08750

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