Nat Methods | 徐涛/纪伟团队开发出三维纳米分辨率干涉定位显微镜ROSE-3D

在生命科学研究中，解析细胞内各种亚细胞结构以及蛋白质机器的纳米尺度空间分布，是理解其生理功能和生命活动机制的关键。光学显微镜因具备高特异性和原位成像优势，成为细胞生物学研究中的重要工具。

2014年获得诺奖的单分子定位显微镜（Single-Molecule Localization Microscopy,SMLM），通过确定单个荧光分子的位置，成功实现了约20纳米的分辨率，为生物学研究带来了革命性的工具。然而，现有SMLM技术主要依赖对单分子图像的中心位置进行拟合估计，定位精度高度依赖于图像的形状和光子数。当单分子处于焦面不同深度时，会因离焦使得单分子图像远大于点扩散函数，导致定位精度下降。同时，轴向（Z方向）方向的定位精度通常比横向（XY方向）方向低2到3倍，导致三维成像的分辨率存在方向以及位置的差异性。这种各向异性分辨率限制了对三维亚细胞结构的精确解析。

为解决上述问题，徐涛/纪伟团队在发展的干涉单分子定位显微镜ROSE（Nature Methods 2019）和ROSE-Z（Nature Methods 2021）基础上（）， 在Nature Methods上发表了文章Molecular-scale Isotropic 3D Super-Resolution Microscopy via Interference Localization。 研究团队成功开发的三维干涉单分子定位显微镜（ROSE-3D），首次在纳米尺度上实现了基于相机和单物镜的三维各向同性分辨率单分子定位显微成像。干涉定位的基本原理是使激发光发生干涉，产生明暗变化的干涉条纹激发荧光分子，并基于不同条纹中的光子数进行定位，从而减少对单分子图像形状的依赖（如图1）。

图1.干涉定位原理

ROSE-3D通过设计基于光电偏转器的高速照明切换光路，成功在X、Y、Z三个方向同时引入干涉光，并实现了小于1微秒的切换时间。基于该设计，ROSE-3D技术实现了基于相机的高通量单分子三维干涉定位（图2a），并实现了分子尺度的三维各向同性分辨能力。该技术利用干涉定位原理，有效避免了对单分子图像形状的依赖，在超过一微米厚的单层景深范围内，可将横向定位精度提高2–6倍，轴向定位精度提升3.5–8倍（图2b）。得益于其卓越的三维解析能力，ROSE-3D仅需层成像，即可对细胞内厚度约1微米范围的微管蛋白中空结构实现纳米级分辨率的清晰解析（图2c-d）。

图2.ROSE-3D的工作原理及对微管中空结构的解析

哺乳动物细胞核的核纤层主要由核纤层蛋白Lamin A/C和Lamin B组成，在维持细胞核结构与功能中起着关键作用。先前的研究表明，A/C型核纤层蛋白分布于B型核纤层蛋白内侧【1】。然而，受限于传统成像技术的各向异性分辨率，此前难以在三维角度上精确解析这两种蛋白在纳米级别的空间位置关系。借助ROSE-3D技术，研究团队成功对厚度约4.3 μm的完整细胞核核纤层进行了成像，并清晰区分了AF647标记的Lamin A/C与CF660C标记的核Lamin B 1 。成像结果显示，Lamin A/C定位于Lamin B 1 的内侧,两者之间的平均间距约为 10 nm（图3a-b）。这一发现进一步验证了早期研究，并凸显了 ROSE-3D 技术在全细胞范围内实现各向同性高分辨率成像的强大能力。

图3.ROSE-3D对全细胞核纤层蛋白及DPR1复合物结构的解析

线粒体是细胞内负责能量产生、细胞凋亡和免疫反应等重要功能的关键细胞器，其形态通过持续的分裂与融合动态变化。线粒体分裂主要由动力蛋白相关蛋白1（dynamin-related protein 1，DRP1）介导。此前，冷冻电镜研究已观察到纯化的DRP1蛋白在脂质管上组装形成环状或螺旋状结构，由此推测它会在线粒体外膜周围形成环状或螺旋状结构【2】。然而，冷冻电镜缺乏特异性，而荧光显微镜受限于三维分辨率的各向异性，DRP1在线粒体分裂位点的原位组装结构仍有待探索。本研究团队利用ROSE-3D技术的各向同性分辨率优势，对DRP1复合物进行了三维高清成像，成功解析出其环状或螺旋状的组装结构（图3d-e），并进一步开展了形状、直径及螺旋间距等形态学参数的分析。这也是首次在细胞原位实现对该蛋白复合体结构的纳米级解析，充分展现了ROSE-3D在阐明蛋白质复合物原位结构方面的强大潜力。

综上，ROSE-3D作为一项全新的三维多色纳米分辨率成像技术，能够以超高分辨率实现对亚细胞器结构以及生物大分子复合物的精准定位与组装分析，为细胞原位三维纳米结构的研究提供了强有力的技术支持。该技术突破了传统光学超分辨成像分辨率各向异性的瓶颈，成功克服了成像方向和深度上的不均一性难题，首次实现了分子尺度的三维各向同性超分辨率成像。ROSE-3D在解析生物样品内各种三维纳米结构，以及揭示生物大分子的原位组装机制等方面具有重要意义。目前，该技术已在怀柔科学城成功实现落地转化，欢迎志同道合的人士加入，一起助力高端科学仪器国产化。

徐涛院士、纪伟研究员和谷陆生正高工是该论文的共同通讯作者，博士后罗世行、博士生赵先傲、副研究员李媛媛和副研究员樊春燕为共同第一作者。纪伟团队研究生刘瑞娜、龚燃，正高工李尉兴、副研究员马娜娜及郑州大学杨郑鸿研究员为本研究做出重要贡献。该工作得到中国科学院生物物理研究所生物成像中心高级工程师冯韵的协助。

https://www.nature.com/articles/s41592-025-02911-z

制版人： 十一

参考文献

1. Nmezi, B., et al., Concentric organization of A-and B-type lamins predicts their distinct roles in the spatial organization and stability of the nuclear lamina.Proceedings of the National Academy of Sciences, 2019. 116(10): p. 4307-4315.

2. Kalia, R., et al., Structural basis of mitochondrial receptor binding and constriction by DRP1.Nature, 2018. 558(7710): p. 401-405.

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