金源康生物 | Hep G2（人肝癌细胞）培养指南

Hep G2细胞是来自15岁男性白人的组织；Hep G2细胞形态为上皮细胞样，模式染色体数为55；Hep G2细胞在免疫抑制小鼠中不致瘤。

一、细胞介绍

1.1.细胞参数

【细胞名称】 HepG2人肝癌细胞

【别称】HEP-G2; Hep G2; HEP G2; HepG2

【种属】 人

【年龄】（周龄）男；15岁

【组织来源】 肝癌组织

【细胞类型】 肿瘤细胞

【细胞形态】 上皮细胞样

【生长特性】 贴壁生长

【细胞类型】 肿瘤细胞

【细胞来源】15岁白人男性肝细胞癌组织

【表达标记物】 甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、胰岛素受体、IGF II受体等

【生长培养基】 MEM + 10% FBS + 1% 非必需氨基酸 （NEAA）+1%PS

【推荐传代比例】 1：2-1：4

【推荐换液频率】 2~3次/周

【倍增时间】 50-60 hours

【生物安全等级】 BSL-1

【冻存条件】 液氮储存

【培养条件】 气相：空气，95%；CO2，5%；温度：37℃

【活性特征】 表达3-羟基-3-甲酰辅酶A还原酶和肝甘油三酯脂肪酶活性

【主要应用】 肝细胞代谢、肝癌生物学、药物筛选等研究

【保藏机构】 ATCC; HB-8065 BCRC; 60025 BCRJ; 0103 DSMZ; ACC-180 ECACC; 85011430

所用产品：

1.2.质控信息

【无菌检测】阴性

【支原体检测】阴性

【物种/STR鉴定】正确

二、培养操做

2.1、复苏培养操作

（1）恒温水浴锅预热至37℃备用，或者细胞复苏仪开机预热准备；

（2）准备15ml离心管，并向其中加入8ml完全培养基（JYK-CT-0126M）待用；

（3）将细胞冻存管从-80℃冰箱或液氮中取出，放入PE手套中，迅速投入恒温水浴锅中或者直接置于细胞复苏仪中；

（4）在恒温水浴锅中，用力摇晃冻存管，使其在1分钟内融化；在细胞复苏仪中，按照程序操作即可；

（5）用纸巾或无尘布擦拭水渍，75%酒精消毒后转移至生物安全柜或者超净工作台。用移液枪吸取细胞悬液，缓慢滴加到步骤2中准备好的离心管；

（6）1000rpm离心5min；

（7）离心后弃上清，用新鲜完全培养基（JYK-CT-0126M）重悬细胞，混匀取样20ul计数后，根据实验需要接种至新的无菌培养器皿中；

（8）镜检细胞状态，拍摄100x、200x照片各3张；

（9）置于37℃，5%CO2培养箱中进行培养，24h后镜检观察细胞复苏情况（贴壁情况）。

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2.2、传代培养操作

（1）取培养中的细胞，镜下观察细胞汇合度和生长状态，若细胞汇合至90%以上，即可传代，拍摄100x、200x照片各3张；

（2）去除培养上清，加入PBS（JYK-SH-001）清洗细胞（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）；

（3）加入0.25%胰酶（JYK-SX-002）（T25瓶，加入2ml；T75瓶，加入4ml），放入培养箱中或者室温下消化解离3min左右，可用显微镜观察状态，若观察到细胞离散成单个圆形、细胞间出现间隙、呈沙状移动，并悬浮在培养基中即可；

（4）加入完全培养基（JYK-CT-0126M）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）终止消化，反复吹打瓶底和细胞，使其充分悬浮并吸取到离心管中，用PBS（JYK-SH-001）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）再洗培养瓶一次，将两次液体收集到一支离心管中；

（5）1000rpm离心10min；

（6）离心后弃上清，轻轻敲击细胞沉淀，使其散开，加入1ml完全培养基（JYK-CT-0126M）稀释并充分混匀；

（7）计数，吸取细胞液20ul，加入20ul台盼蓝染液，混合均匀后吸取20ul混合液加入到细胞计数板计数，根据接种密度计算所需细胞液体积；

（8）根据实验需要，吸取一定量的细胞液加入到培养瓶，加入完全培养基（JYK-CT-0126M）（T25瓶，加入10ml；T75瓶，加入20ml），轻轻前后摇匀，在瓶身写好细胞名、培养代数、日期、姓名；

（9）镜下观察看是否已经摇匀，无误后放入培养箱37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养。

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2.3、冻存操作

（1）取培养中的细胞，镜下观察细胞汇合度和生长状态，若细胞汇合至90%以上，即可传代，拍摄100x、200x照片各3张；

（2）去除培养上清，加入PBS（JYK-SH-001）清洗细胞（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）；

（3）加入0.25%胰酶（JYK-SX-002）（T25瓶，加入2ml；T75瓶，加入4ml），放入培养箱中或者室温下消化解离3min左右，可用显微镜观察状态，若观察到细胞离散成单个圆形、细胞间出现间隙、呈沙状移动，并悬浮在培养基中即可；

（4）加入完全培养基（JYK-CT-0126M）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）终止消化，反复吹打瓶底和细胞，使其充分悬浮并吸取到离心管中，用PBS（JYK-SH-001）（T25瓶，加入5ml；T75瓶，加入10ml）再洗培养瓶一次，将两次液体收集到一支离心管中；

（5）1000rpm离心10min；

（6）将离心后的细胞液倒掉上清，轻轻敲击细胞沉淀，使其散开，加1ml预冷冻存液（JYK-SD-003）混匀；

（7）计数，吸取细胞液20ul，加入20ul台盼蓝染液，混合均匀后吸取20ul混合液加入到细胞计数板计数；

（8）根据计数结果，添加冻存液（JYK-SD-003），调整细胞最终密度为5×106/ml；

（9）将细胞分装入冻存管中，每管1ml；

（10）冻存管标记细胞名称，细胞代数、细胞密度、冻存时间，操作者。

（11）按照冻存程序进行细胞冻存。参考冻存程序见下表：

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三、注意事项

1.维持pH7.2是细胞贴壁和增殖的最佳条件。需定期监测，避免pH<7.0导致退化或>7.0引起贴壁困难。建议使用含碳酸氢钠缓冲系统的培养基，并在CO₂培养箱（5% CO₂）中稳定pH；

2.每2-3天换液一次，清除代谢废物并补充营养。快速增殖阶段可缩短至48小时，确保葡萄糖和谷氨酰胺充足；

3.IGF-1（50 ng/mL）联合IGFBP2可通过激活AKT/ERK通路显著促进HepG2增殖。

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