FSHW | 芦荟苷通过减轻炎症和调节肠道菌群改善小鼠盲肠结扎和穿刺引起的脓毒症

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Introduction

芦荟属（Aloe）的大多数物种被用作新型食品或功能性食品成分。尽管芦荟苷（Alo）作为从芦荟属植物中分离得到的一种蒽醌化合物，其健康益处广为人知，但其抗炎作用及潜在机制仍未阐明。通过盲肠结扎穿孔术（CLP）建立的脓毒症模型最接近人类脓毒症的临床病程，因此被广泛使用。CLP模型可导致肠道细菌、真菌和代谢物流入腹腔，引起腹腔感染和全身性脓毒症。在本研究中，对CLP诱导的小鼠脓毒症模型中进行了术后芦荟苷处理，并检查了其抗炎效果，分析了免疫细胞和腹腔及肠道菌群的变化。研究结果揭示了芦荟苷针对脓毒症的处理效果，表明其潜在的临床应用前景。

Results

芦荟苷处理改善脓毒症小鼠的生存率

本研究使用CLP诱导的小鼠脓毒症模型评估了芦荟苷（10 mg/(kg·day)）的处理效果。在CLP造模1 h后，通过腹腔注射给予小鼠芦荟苷，并每隔6 h观察一次（图1B）。Sham组观察到100%的生存率，而CLP组在36 h后生存率降至50%（图1C），表明CLP动物模型适用于脓毒症研究。48 h后，CLP组的生存率为43.3%，显著低于Sham组（P＜0.05）。芦荟苷处理组的生存率为73.3%，显著高于CLP组（P＜0.05；图1C）。

图1 Alo在CLP诱导的脓毒症小鼠中显示出显著的处理效果

芦荟苷处理挽救脓毒症小鼠的生理参数

为了研究芦荟苷是否能改善CLP诱导的脓毒症引起的体温变化，在术后每隔4 h测量了体温。清醒后，Sham组小鼠体温（36～37 °C）迅速恢复并保持稳定（图1D）。CLP组小鼠在0～28 h内平均体温低于35 °C，而芦荟苷处理组小鼠的平均体温接近CLP组。处理12 h后，Sham组小鼠活跃，对外部刺激反应迅速。它们毛发光滑有光泽，眼睛明亮，眼角无分泌物，食欲和排泄正常（图1E）。然而，CLP组小鼠表现出毛发颤抖、身体蜷缩、精神萎靡、眼睛无光、眼角有白色分泌物、活动减少、食欲和排泄减少（图1F）。与CLP组相比，芦荟苷处理组表现出聚集现象减少、身体状况、活动和食欲改善（图1G）。此外，根据先前描述的方法分析，芦荟苷处理显著降低了小鼠的炎症反应评分（P＜0.05；图1H），表明对脓毒症小鼠的模具诱导应激反应有所改善。

芦荟苷处理挽救脓毒症小鼠的组织病变

Sham组肺组织保持完整的肺泡网状结构，肺泡之间无炎症细胞浸润，肺泡间隔膜薄，无明显增厚（12 h，图2A-C）。在CLP组中，肺组织肺泡壁明显增厚，血管壁和肺泡之间出现免疫细胞浸润，组织水肿和出血明显。Sham组肝组织完整，无免疫细胞浸润，肝细胞在血管附近呈放射状排列，少数肝细胞呈双核结构（图2E-G）。CLP组小鼠肝细胞肿大，细胞间隙显著减小，放射状排列不规则，血管壁周围有显著的炎症细胞浸润，并在24 h后增加。芦荟苷处理后，肝、肺和肾组织的炎症评分显著降低（P＜0.05；图2），表明芦荟苷对脓毒症小鼠这些组织病变和坏死具有保护作用。

图2 Alo处理改善了脓毒症小鼠的肺、肝和肾组织损伤

芦荟苷处理降低脓毒症小鼠的促炎因子表达水平

与Sham组相比，CLP组小鼠血清细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12）水平在CLP后12 h显著升高（P＜0.05；图3A-E）。然而，与CLP组相比，芦荟苷处理组的这些细胞因子水平显著降低（P＜0.05；图3A-E），接近Sham组水平。在肺组织中，与Sham组相比，CLP组细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12）的蛋白水平显著升高（P＜0.05；图3F-J）。然而，与CLP组相比，芦荟苷处理后脓毒症小鼠相同细胞因子的水平显著降低（P＜0.05）。CLP组细胞因子mRNA表达水平与Sham组相比显著上调（P＜0.05；图4A-E）。芦荟苷处理后，IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12的表达水平较CLP组显著下调（P＜0.05）。

在肝组织中，CLP组细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12）的蛋白表达水平与Sham组相比显著增加（P＜0.05；图3K-O）。然而，芦荟苷处理显著降低了CLP小鼠肝组织中IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12的表达（P＜0.05；图3K-O），与Sham组相似。此外，CLP模型组细胞因子mRNA表达水平与Sham组相比显著上调（P＜0.05；图4F-J），而芦荟苷处理后小鼠的表达显著下调（P＜0.05）。

在肾组织中观察到类似结果，CLP诱导IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12表达（P＜0.05），而芦荟苷处理将表型挽救至Sham组蛋白水平（P＜0.05；图3P-T）。CLP后IL-1α、IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12的mRNA表达显著上调（P＜0.05），芦荟苷处理后下调（P＜0.05；图4K-O），表明芦荟苷处理对肾脏损伤有保护作用。

这些结果表明，芦荟苷处理（10 mg/(kg·day)）减轻了CLP诱导的小鼠肺、肝和肾组织炎症反应，促炎因子显著上调。

图3 Alo处理在12 h内降低了脓毒症小鼠的促炎因子水平

图4 Alo处理在12 h内降低了脓毒症小鼠的促炎因子水平

芦荟苷对脓毒症小鼠免疫细胞的影响

通过分析脓毒症小鼠外周血的定量、分布和病理变化，以及芦荟苷处理前后的影响，研究了芦荟苷对脓毒症小鼠循环免疫细胞的影响。CLP造模后白细胞（WBC）数量显著增加（P＜0.05；图5A），而芦荟苷组的WBC计数显著低于CLP组（P＜0.05），与Sham组相似。WBC包括单核细胞、淋巴细胞和粒细胞，它们在免疫系统中起重要作用。与Sham组相比，CLP后粒细胞（图5B）、淋巴细胞（图5C）和单核细胞（图5D）数量显著增加（P＜0.05）。然而，与CLP组相比，芦荟苷组的粒细胞和单核细胞数量显著减少（P＜0.05），淋巴细胞数量也显著减少（P＜0.05）。CLP组血小板和PCT显著降低（P＜0.05），而芦荟苷组血小板计数和体积显著增加（P＜0.05；图5E-F）。Sham组小鼠腹腔积液中巨噬细胞水平为62.6%，CLP后12 h增至73.7%（P＜0.05；图5G-J）。此外，芦荟苷处理组的巨噬细胞为91.5%，显著高于CLP组（P＜0.05；图5J）。这些发现表明，CLP造模后小鼠产生大量腹腔巨噬细胞以对抗盲肠穿孔引起的感染，而芦荟苷处理可以刺激巨噬细胞产生并抑制细菌感染引起的炎症。

图5 Alo处理对脓毒症小鼠免疫细胞的影响

芦荟苷处理影响肠道微生物群的多样性

研究了芦荟苷处理对脓毒症小鼠肠道微生物群多样性和丰度的影响。在处理组中鉴定出373个共同特征，其中CLP模型、芦荟苷处理组和Sham组分别有29、12和6个独特特征（图6A）。CLP介导的小鼠肠道细菌特有菌群增加在芦荟苷处理后减少，恢复了肠道菌群稳态并减轻了炎症反应。

主坐标分析（PCoA）用于研究不同处理组之间肠道微生物群落的差异。不同处理组的数据点是分离的，代表实验组的圆圈仅部分重叠（图6B），并且可以在处理组之间清楚地区分协调位置。这些结果表明CLP造模或芦荟苷处理可以改变小鼠肠道菌群的结构。

CLP组的Simpson和Shannon指数与Sham组相比显著不同，而芦荟苷组的多样性较CLP组增加（P＜0.05；图6C-D）。这些发现表明CLP增加了小鼠肠道微生物群的丰度，而芦荟苷处理改善了肠道微生物群的多样性并维持了肠道微生物群稳态。

图6 不同实验组小鼠肠道微生物群丰度的Alo影响

芦荟苷对肠道微生物群组成的影响

在属水平上，Akkermansia、Escherichia、Klebsiella、Lactobacillus、Bacteroides和Lachnospiraceae_NK4A136_group是小鼠肠道微生物群中最丰富的属（图6E-F）。Ruminococcaceae_UCG_014、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Escherichia在CLP模型组中高于Sham组；然而，Lactobacillus的丰度低于Sham组（图6G-J）。芦荟苷处理显著降低了Lachnospiraceae_NK4A136_group、Escherichia和Ruminococcaceae_UCG_014（P＜0.05）的丰度，而芦荟苷处理组的Lactobacillus丰度显著增加（P＜0.05），高于CLP模型组。Lactobacillus在维持肠道微环境平衡中起重要作用，产生醋酸盐、乳酸盐和抗菌物质，阻止病原体大量繁殖，促进肠道健康。这些结果表明芦荟苷可以促进有益菌生长并抑制有害菌生长。

小鼠肠道微生物群的线性判别分析效应大小（LEfSe）

通过LEfSe分析检查了Sham、CLP和芦荟苷处理组的微生物群。以LDA＞4为筛选条件，检测到42个物种信息存在显著差异。Lactobacillus是Sham组的主要细菌。Clostridia、Clostridiales和Escherichia在CLP组中高于Sham组。

脓毒症小鼠肠道短链脂肪酸（SCFAs）和胆汁酸（BAs）水平

CLP组中醋酸、丙酸、异丁酸、戊酸和异戊酸的含量显著增加，而丁酸含量与Sham组相比显著减少（P＜0.05；图7A-F）。在Sham组或芦荟苷组中均未检测到异丁酸。芦荟苷处理后，醋酸、丙酸、丁酸、异丁酸和戊酸含量与CLP组相比显著降低（P＜0.05；图7A-F）。

随后，测定了不同实验组粪便样本中个体胆汁酸的精确浓度。CLP组粪便中脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、β-鼠胆酸、鼠胆酸和异石胆酸的浓度增加（P＜0.05；图7G-L）。芦荟苷处理后，与CLP组相比，脱氧胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺鹅脱氧胆酸、β-鼠胆酸、鼠胆酸和异石胆酸的水平显著降低（P＜0.05；图7G-L）。

受这些发现的启发，进行了一项研究，以检验芦荟苷对CLP诱导的脓毒症小鼠肠道屏障功能的影响。与CLP组相比，芦荟苷在CLP诱导的脓毒症小鼠口服FITC-葡聚糖后，并未显示出抑制FITC-葡聚糖全身暴露的作用（P＜0.05；图7M）。

图7 阿洛对脓毒症小鼠粪便中肠道代谢物含量的影响

小鼠肠道微生物群与环境因素的关联分析

对小鼠血清促炎因子和肠道SCFAs以及肠道菌群进行了相关性分析（图7O）。在属水平上，Lactobacillus、Lactococcus、Prevotellaceae_UCG-001、Klebsiella和Alloprevotella与小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平呈负相关（P＜0.05）。Lachnospiraceae_NK4A136_group和Ruminococcaceae_UCG-014与小鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平呈正相关。与丁酸水平显著正相关的细菌包括Prevotellaceae_UCG-001、Akkermansia和Klebsiella。然而，Bacteroides、Parabacteroides、Helicobacter、Parasutterella和Allobaculum与丁酸水平呈负相关。值得注意的是，Lachnospiraceae_NK4A136_group和Ruminococcaceae_UCG-014与IL-1β、IL-6和TNF-α、醋酸和异丁酸呈正相关。Escherichia与丙酸、戊酸、醋酸和异丁酸呈正相关。

预测小鼠肠道微生物群功能

组间功能基因预测鉴定出CLP组和芦荟苷处理组之间存在显著差异的13个代谢通路。差异最大的前3个术语是药物耐药性：抗菌、细胞运动和信号转导。前3个丰度包括碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢。其中，药物耐药性：抗菌和信号转导倾向于出现在CLP组，这可能是CLP影响小鼠肠道菌群的主要机制。能量代谢和碳水化合物代谢倾向于出现在芦荟苷处理组，这可能是芦荟苷影响小鼠肠道菌群的主要机制。这些结果表明芦荟苷调节小鼠肠道微生物群并导致肠道微生物群功能改变。

Saa3、Ly6g、Orm1和Il10被确定为芦荟苷处理CLP诱导的脓毒症小鼠的处理靶点

进行全基因组RNA测序分析，以检测芦荟苷在脓毒症中保护作用的潜在机制。基因表达谱（图8A）和差异表达基因（DEGs）（图8B）以热图形式可视化。芦荟苷恢复了与NF-κB信号通路（NFKB1）、Rap1 MAPK信号通路（Ly6g、Fpr1和Foxk1）、磷脂酰肌醇信号系统（Pik3c2b和Pi4k2b）相关的基因的原始表达（图8A-B）。它还导致与RNA转运（Eif4a1、Eif3b和Eif3d）；Rap1信号通路（Fpr1）；炎症（I110、Jun、Saa3、Orm1和Zc3h12a）；以及磷脂酰肌醇信号系统（Pip4k2c和Pip4k2b）相关的基因表达减少（图8A-B）。为了更深入地了解芦荟苷调节的信号通路，实施了DEGs的基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析。观察到CLP导致TNF信号通路、癌症通路和IL-17信号通路的明显上调，而芦荟苷抑制了与凋亡过程、炎症和RNA转运相关的通路（图8C-D）。火山图和Venn图揭示了CLP诱导了Orm1、Saa3、Il10、Foxk1和Eif4al，以及芦荟苷处理抑制了NFKB1和Pik3c2b（图8E-F）。STRING分析显示Saa3、Ly6g、IL-10、Orm1、Fpr1和Zc3h12a蛋白之间存在功能相互作用（图8G）。RT-qPCR分析显示CLP诱导了Saa3、Ly6g、Orm1、Il10、Fpr1和Zc3h12a，并被芦荟苷处理抑制（图8H-M）。芦荟苷处理后，TLR-2/4/NF-κB/NLRP3/Caspase-1/3/8的比值显著降低，表明芦荟苷抑制了NF-κB/NLRP3通路激活；芦荟苷通过抑制TLR-2/4/NF-κB（P < 0.05）抑制炎症细胞因子表达并减弱NLRP3炎性体激活（图9）。总而言之，这些发现揭示Saa3、Ly6g、Orm1和IL-10可能是芦荟苷处理CLP诱导脓毒症的多效性作用的关键因子，芦荟苷通过抑制TLR-2/4/NF-κB/NLRP3/Caspase-1/3/8信号通路来保护免受CLP的影响。

图8 CLP诱导的脓毒症小鼠在Alo处理下的基因谱分析

图9 Alo处理对CLP诱导的脓毒症小鼠TLR-2/4/NF-κB/NLRP3/Caspase-1/3/8信号通路的影响

Conclusion

芦荟苷抑制了脓毒症小鼠促炎因子的上调，保护了内脏损伤，改善了免疫调节，并调节了脓毒症小鼠的肠道微生物群组成。芦荟苷通过促进有益菌的增殖和减少致病菌的生长来发挥这些作用。芦荟苷可以调节微生物群功能并影响TLR-2/4/NF-κB/NLRP3/Caspase-1/3/8信号通路。尽管Saa3、Ly6g、Orm1和IL-10已被确定为芦荟苷处理CLP诱导的脓毒症小鼠的处理靶点，但其确切作用机制仍需进一步探索。

Aloin ameliorates cecal ligation and puncture-induced sepsis in mice by attenuating inflammation and modulating gut microbiota

Jingqian Sua,1, Jianbin Xiaoa,b,1, Siyuan Chena,b,1, Heng Zhaoa,1, Xiaoni Zhanga,b, Zhihua Fenga, Kunsen Chena, Biyun Guana, Wenzhi Chena, Youqiang Chenb, Duo Chenb,*, Chen Qia,*

a Fujian Key Laboratory of Innate Immune Biology, Biomedical Research Center of South China, College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China

b The Public Service Platform for Industrialization Development Technology of Marine Biological Medicine and Products of the State Oceanic Administration, Fujian Key Laboratory of Special Marine Bioresource Sustainable Utilization, Southern Institute of Oceanography, College of Life Science, Fujian Normal University, Fuzhou 350117, China

1 Both authors contributed equally.

*Corresponding author.

Abstract

Most Aloe species are used as new food or functional food ingredient. Even though widely known for its health benefits, the anti-inflammatory effects and underlying mechanisms of Aloin (Alo), an anthraquinone compound isolated from plant species of the genus Aloe, remain unidentified. Here, we investigated the protective effects of Alo against cecal ligation and puncture (CLP)-induced sepsis and microflora in mice. Alo significantly improved CLP-induced sepsis and the survival rate of septic mice, downregulated the expression of proinflammatory factors, and decreased the infiltration of inflammatory cells in tissues. Alo upregulated the proportion of peritoneal macrophages, reduced the number of peritoneal bacteria, decreased the content of short-chain fatty acids and bile acids in the abdominal cavity, and suppressed Toll-like receptor (TLR)-2/4/nuclear factor kappa-B (NF-κB)/NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3 (NLRP3)/Caspase-1/3/8 signaling. Furthermore, Alo altered the composition of the microbiome and promoted the growth of Lactobacillus, which showed a stronger anti-inflammatory effect. Whole-genome analysis identified the genes Saa3, Il10, Fpr1, and Eif4a1 associated with the protective effects of Alo in mice with CLP-induced sepsis. Overall, our results provide novel insights into the therapeutic potential and mechanism of action of Alo in the treatment of sepsis.

Reference:

SU J Q, XIAO J B, CHEN S Y, et al. Aloin ameliorates cecal ligation and puncture-induced sepsis in mice by attenuating inflammation and modulating gut microbiota[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(2): 9250034. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250034.

翻译： 管勤昊（实习）

编辑：梁安琪；责任编辑：孙勇

封面图片：图虫创意