JVI® | 高致病性病毒与生物安全全国重点实验室: 呼吸道合胞病毒磷蛋白具有NTPase及类解旋酶活性

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介绍

呼吸道合胞病毒（RSV）是肺炎病毒科正肺炎病毒属中的一种非节段性负链单链RNA病毒（NNSV），是全球范围内重大的健康负担。作为一种广泛存在的病原体，RSV几乎可感染所有2岁以下儿童；在全球范围内，该病毒每年导致5岁以下儿童急性下呼吸道感染超3,000万例，进而引发360万例住院治疗及约10万例死亡。除儿童群体外，RSV还会导致免疫功能低下成人及老年人出现较高的发病率和死亡率，凸显其对易感人群的严重威胁。尽管经过数十年研究，针对RSV的治疗与预防手段仍十分有限，因此亟需深入探究调控RSV复制与致病机制的分子基础。

RSV基因组全长约15.2千碱基（kb），通过10个基因编码11种蛋白质。其中，核蛋白（N）、磷蛋白（P）与大聚合酶蛋白（L）共同构成病毒增殖所必需的最小复制复合物。N蛋白可包裹病毒RNA形成核糖核蛋白（RNP）复合物，保护病毒RNA免受宿主固有免疫传感器及核酸酶的识别与降解。与之相对，P蛋白是L聚合酶的关键辅助因子：一方面将L聚合酶锚定在N-RNA模板上，另一方面可防止新合成的N蛋白过早与宿主RNA结合。

RNA解旋酶是一类在多种RNA病毒中高度保守的酶，对病毒RNA的复制与转录至关重要。这类酶通过水解核苷三磷酸（NTP）提供能量，在复制过程中解开结构化的RNA双链、消除RNA二级结构并分离基因组链。目前已有研究报道，多种RNA病毒可编码具有RNA解旋酶或类解旋酶活性的病毒蛋白，包括小核糖核酸病毒2C、肠道病毒71 2C、诺如病毒NS3、黄病毒NS3、甲病毒nsP2、冠状病毒Nsp13、质型多角体病毒VP5和丝状病毒VP35。这些具有RNA解旋酶或类解旋酶活性的病毒蛋白在病毒RNA复制中发挥核心作用，因此被认为是开发抗病毒药物的理想靶点。然而，对RSV编码蛋白的生物信息学分析显示，其蛋白中不存在保守的典型NTPase/解旋酶基序；目前尚不清楚RSV或肺炎病毒科的任何成员是否能编码具有RNA解旋酶或类解旋酶活性的蛋白——这一认知空白严重阻碍了对RSV复制机制的理解，也凸显出重新评估RSV蛋白功能谱的必要性。

我们此前的研究发现，埃博拉病毒（EBOV，一种高致病性NNSV）编码的VP35蛋白具有类解旋酶活性：该蛋白可水解所有类型的NTP，并以NTP依赖的方式解开RNA双链。值得注意的是，EBOV VP35同样不含有保守的典型NTPase/解旋酶基序。尽管EBOV VP35与其他NNSV编码的P蛋白在结构上存在差异，但由于二者具有保守的功能模块且在病毒复制中发挥相似作用，因此被视为NNSV中的功能类似物。基于此，探究RSV P蛋白是否也具有与EBOV VP35相似的类解旋酶活性，成为一个极具研究价值的方向。

本研究首次证实，RSV P蛋白具有内在的NTPase活性，且能以NTP水解为能量依赖，沿5’至3’方向解开RNA双链。关键的是，突变实验证实NTPase功能是RSV P蛋白类解旋酶活性不可或缺的前提；而反向遗传学实验、RSV微型基因组实验及抗病毒效应实验均表明，破坏这些酶活性会严重损害RSV的存活能力。这些发现不仅重新定义了RSV P的多功能属性，也拓展了人们对RSV复制机制现有范式的认知。

图1 RSV P具有NTPase活性。

（A）将20 pmol MBP-P与指定NTP（2.5 mM）共同孵育。采用高灵敏度比色法检测NTPase活性，以释放的无机磷酸（Pi）的纳摩尔量表示。

（B）将2.5 mM ATP分别与浓度梯度递增的MBP或MBP-P共同孵育。

（C）将20 pmol MBP-P与2.5 mM ATP和1 mM的指定二价金属离子共同反应。

（D）将20 pmol MBP或MBP-P与2.5 mM ATP在指定浓度的MgCl2条件下共同反应。误差线代表三次独立实验的标准差（SD）。

论文信息

论文标题：

呼吸道合胞病毒磷蛋白具有NTPase及类解旋酶活性

作者：

Ting Shu、Xiaotong Wang、Yiyang Li、Jiaoling Su、Haiwu Zhou、Mengyu Hu、Puyu Yang、Chao Shan、Yang Qiu、Xi Zhou

机构：

1. 中国科学院武汉病毒研究所高致病性病毒与生物安全全国重点实验室

2. 中国科学院大学

3. 湖北生物学基础学科研究中心、武汉大学生命科学学院，武汉病毒研究所高致病性病毒与生物安全全国重点实验室

https://journals.asm.org/doi/10.1128/jvi.00996-25

摘要

呼吸道合胞病毒（RSV）是肺炎病毒科中的一种非节段性负链RNA病毒（NNSV）。该病毒是全球重要的健康负担，可导致婴幼儿及免疫功能低下成人发生严重的下呼吸道感染。RNA解旋酶可通过RNA重塑功能调控病毒复制，是病毒复制的关键因子，但RSV中是否存在此类酶活性尚不明确。本研究发现，尽管RSV磷蛋白（P）缺乏典型的解旋酶基序，却具有核苷三磷酸酶（NTPase）活性，且能以NTP依赖的方式，沿5’至3’方向解开RNA双链。通过突变实验，我们证实NTP水解活性与类解旋酶活性存在功能偶联。重要的是，反向遗传学实验、RSV微型基因组实验及抗病毒效应实验均表明，RSV P的类解旋酶活性对病毒存活及复制至关重要。这些发现明确了P是RSV复制所需的关键酶促成分，为肺炎病毒属病毒的增殖机制提供了新见解。

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