Sci Adv.I 甲型流感病毒劫持LC3-中心粒周围蛋白-动力蛋白衔接复合物实现宿主细胞质入侵

2025年6月11日由奥胡斯大学Fulvio Reggiori团队在《Science Advance》杂志上发表题为“Influenza A virus subverts the LC3-pericentrin dynein adaptor complex for host cytoplasm entry”的研究论文。

研究背景

甲型流感病毒（IAV）是一种重要的人类呼吸道病原体。其基因组包裹在病毒核糖核蛋白（vRNP）复合体中，该复合体进入细胞后，需通过“脱壳”将遗传物质释放到细胞质中，进而感染宿主。以往研究表明，IAV 可利用细胞内“聚集小体加工机制”（APM），通过组蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）识别 vRNP 上的非锚定泛素链，进而驱动微管和肌球蛋白运动，促进病毒脱壳。此外，转运蛋白TNPO1等因子也参与部分脱壳过程，但这些途径被抑制后，病毒感染仅部分受损，暗示存在其他机制。本研究揭示了另一条关键通路：自噬相关蛋白 LC3 与 pericentrin（PCNT）形成衔接复合体，直接介导 vRNP 与驱动蛋白dynein 1 的结合，从而在病毒进入细胞的内体位置启动脱壳。该机制与HDAC6依赖的APM通路并行，形成功能冗余，表明IAV已进化出两种冗余策略来劫持动力蛋白分子马达，以高效完成细胞质入侵。

研究结果

结果1：

HDAC6并非介导IAV细胞质入侵的唯一动力衔接蛋白

为揭示IAV利用细胞动力蛋白入侵细胞质的具体途径，作者首先利用siRNA技术分别抑制了宿主细胞内的HDAC6（已知的病毒脱壳相关蛋白）和DYNC1I1（动力蛋白1的核心组分）。实验结果表明，抑制HDAC6仅能使IAV的感染效率下降约50%，而抑制DYNC1I1则几乎完全阻断了病毒的复制。为进一步探究细胞骨架的作用进一步采用了药物干预。发现单纯解聚微管只能部分抑制IAV复制，而直接抑制动力蛋白功能或阻断内体酸化则能实现近90%的强烈抑制。尤为关键的是，当同时破坏微管和肌动蛋白时，其对病毒复制的抑制效果与直接靶向动力蛋白相当，这说明IAV所利用的动力蛋白系统需要这两种细胞骨架网络的协同配合。此外，研究还证实这种依赖具有病毒特异性，并非所有病毒都同样需要此通路。在细胞质入侵的实验中，作者发现，当DYNC1I1被抑制后，病毒蛋白M1几乎完全被禁锢在内体结构中无法释放；而HDAC6被抑制时，仅出现部分滞留。这为DYNC1I1是病毒实现细胞质入侵的关键枢纽提供了最直观的证据，并最终确证：HDAC6并非IAV用以连接并利用动力蛋白系统的唯一适配器。

果2：LC3蛋白而非完整自噬机制对IAV感染至关重要

为探究IAV如何利用动力蛋白，作者首先利用基因敲除细胞系发现，缺失全部三种LC3蛋白（LC3A/B/C）会显著抑制IAV感染，而缺失另一亚家族GABARAPs则无影响，这表明LC3s在IAV感染中具有独特且关键的作用。进一步实验表明，三种LC3异构体在功能上存在冗余，任一成员均能恢复LC3缺失细胞中的病毒感染能力。为研究其是否依赖于经典自噬途径，作者在缺失自噬关键蛋白（如ATG7、ATG13或ATG16L1）的细胞发现自噬核心蛋白的缺失并不影响病毒复制，证明LC3s促进IAV感染的功能独立于完整的自噬机制。更重要的是，研究人员构建了多种LC3B突变体，发现即使是被改造为无法进行脂化的LC3B变体，也同样能有效支持IAV感染。这最终证实，LC3s是通过其非脂化的“I型”形式，以一种不依赖于自噬的全新机制，在IAV感染周期中发挥关键作用。

结果3：LC3促进IAV从LAMP1阳性晚期内体脱壳

本研究进一步探究了LC3s在IAV感染周期中的具体作用环节。通过细胞质入侵实验发现，在缺失所有LC3s的细胞中，病毒的M1蛋白几乎全部以点状结构被困于细胞内，其状况与使用药物抑制内体酸化的效果类似。共定位分析发现，M1主要与晚期内体标志物LAMP1结合，与早期内体标志物SNX1几乎无共定位，且共定位程度高于正常细胞，表明LC3缺失导致IAV被困于晚期内体。此外，作者还排除了LC3s影响其他早期步骤的可能性，发现病毒与细胞表面的结合以及其内吞过程在LC3s缺失的细胞中均未受影响。同时，其他依赖低pH内体环境入侵的病毒（如HSV-1和VaV）在LC3s缺失细胞中的感染依然正常，这表明LC3s的缺失并未造成普遍的内体功能缺陷，其对IAV感染的抑制是特异性的。

结果4：LC3在IAV细胞质入侵过程中与vRNP及动力蛋白1相互作用

为阐明LC3s分子层面的作用机制，作者通过免疫荧光发现，在IAV感染过程中，部分LC3斑点与病毒M1蛋白共定位，而使用Baf抑制内体酸化则会显著减少此共定位，证明LC3s被特异性招募至病毒vRNPs释放的位点。同时，LC3还能与动力蛋白1亚基DYNC1I1结合，且结合具有特异性-参与自噬体转运的驱动蛋白KIF5B未在共沉淀产物中检出，LC3也不与HDAC6结合，这些结果表明，在IAV细胞质入侵过程中，LC3可作为桥梁，同时结合vRNP与动力蛋白1，且该相互作用独立于HDAC6介导的聚集体处理机制，形成一条新的动力蛋白衔接途径，为vRNP借助动力蛋白实现细胞质入侵提供直接分子连接。

结果5：动力蛋白衔接蛋白PCNT是IAV细胞质入侵的必需因子

本研究旨在揭示连接LC3s与动力蛋白1（Dynein 1）的关键适配器蛋白。通过在感染IAV的细胞中进行LC3免疫共沉淀及质谱分析，研究人员鉴定出15个已知能与动力蛋白相互作用的候选蛋白。随后，通过siRNA逐一敲低这些候选基因并进行功能筛选，发现其中PCNT（ pericentrin ）的缺失能显著抑制IAV复制。进一步的细胞质进入实验证实，敲低PCNT会特异性地阻碍病毒颗粒在内体中的脱壳过程，导致病毒M1蛋白更多地滞留于晚期内体/溶酶体中，但其滞留程度弱于直接敲低动力蛋白亚基DYNC1I1，提示PCNT在此过程中起部分作用。此外，PCNT的缺失并不影响病毒对细胞的附着与内吞，也不影响其他病毒（如HSV-1和VaV）的感染，表明其功能具有IAV特异性。

结果6：IAV感染不依赖于PCNT在中心体组装中的作用

为探究PCNT蛋白在IAV感染中的具体作用机制，首先，研究人员使用药物抑制中心体组装，发现这确实会显著抑制IAV感染，提示中心体结构可能与病毒感染有关。然而，PCNT存在两种剪接异构体（PCNTS和PCNTB），实验证明两者均能有效恢复PCNT缺失细胞中的IAV感染能力，表明它们在功能上具有冗余性。为了直接检验PCNT的病毒相关功能是否依赖于其定位至中心体的能力，研究人员构建了缺失PACT结构域的PCNT突变体。令人意外的是，即使无法定位到中心体，这种突变体依然能够有效支持IAV感染。此外，研究还证实，敲低PCNT、LC3s或动力蛋白亚基DYNC1I1，并不会影响微管网络或中心粒的正常组织结构，排除了因细胞结构破坏间接影响病毒感染的潜在可能。这些结果表明PCNT在促进IAV感染过程中的功能是独立于其在中心体组装中的经典作用的。

结果7：LC3与PCNT形成介导IAV细胞质入侵的动力蛋白衔接复合物

本研究最终阐明了LC3s与PCNT在IAV脱壳过程中的协同作用机制。基因敲低实验显示，同时沉默PCNT和LC3s对病毒感染的抑制效果并未叠加，表明二者作用于同一通路。反之，同时沉默PCNT和HDAC6则能强烈抑制感染，效果与直接敲低动力蛋白亚基DYNC1I1相当，这确证了PCNT/LC3和HDAC6是两条独立且功能冗余的动力蛋白依赖通路。这种机制在不同IAV亚型中存在差异：H1N1和H5N1同时利用这两条通路，而H3N2主要依赖LC3-PCNT模块，提示病毒亚型演化出了不同的细胞质入侵策。为了确定 PCNT 是否是促进 IAV 与 LC3 一起脱衣的动力蛋白 1 接头，我们在耗尽 PCNT 的 atg7−/− 细胞中使用 LC3 抗体进行了IP，发现病毒vRNP与LC3s结合，而PCNT作为关键衔接桥，一端与LC3s（进而间接连接vRNP）关联，另一端直接结合动力蛋白亚基DYNC1I1。值得注意的是，PCNT的缺失并不影响LC3s被招募至病毒所在的内体，但会导致LC3s与病毒蛋白在内体上的滞留增加。这些数据揭示了LC3s和PCNT形成了一个独立的动力蛋白适配器复合物，该复合物与HDAC6通路并行，共同介导病毒颗粒在内体上的脱壳及其后续的细胞质侵入。

本研究首次揭示了一条全新的、独立的脱壳机制：自噬蛋白LC3s与中心体蛋白PCNT在内体上形成一个衔接复合体，该复合体能直接“挟持”细胞内的动力蛋白（Dynein 1），从而将病毒基因组成功“拽”入细胞质。尤为重要的是，LC3s和PCNT在此过程中的功能完全独立于它们已知的自噬和中心体组装功能。当同时抑制这条新通路和已知的APM通路时，对病毒感染的抑制作用最强，证明IAV进化出了两条功能冗余的“双保险”策略来劫持宿主细胞的动力系统，以确保其成功入侵。这项研究极大地深化了我们对流感病毒生命周期的理解，并为开发针对病毒入侵环节的新型广谱抗病毒策略提供了全新的潜在靶点。

原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40498831/

DOI:10.1126/sciadv.adu7602

来源：ZhaoSunLab

编辑：吃一口小猫