血浆游离DNA（cfDNA）提取实验常见问题及注意事项

一、血浆游离DNA（cfDNA）来源于哪里？

游离DNA （Cell-Free Circulating DNA，cfDNA）是指来自细胞凋亡或坏死，游离于细胞外的DNA片段，主要来源于以下几个方面：

（1）正常细胞凋亡与更新：人体内正常细胞（尤其是血细胞）在生命周期结束后会通过程序性死亡（凋亡）释放DNA片段进入血液循环，这是健康人血浆中cfDNA的主要来源。

（2）肿瘤组织释放：肿瘤细胞由于快速增殖、坏死或凋亡，会释放大量DNA进入血液，这些DNA被称为循环肿瘤DNA（ctDNA），是液体活检的重要靶标，用于癌症的早期筛查、疗效监测和复发预测。

（3）感染病原体释放：在细菌、病毒、真菌等感染过程中，病原体死亡后也会释放其DNA进入宿主血液，可用于感染性疾病的诊断（如脓毒症、病毒血症）。

（4）移植器官排斥反应：器官移植后，供体器官细胞受损会释放供体来源的cfDNA，其浓度升高可作为排斥反应的早期指标。

（5）妊娠期胎儿DNA：孕妇血液中存在胎儿来源的cfDNA，主要用于无创产前检测（NIPT），筛查染色体异常如唐氏综合征。

二、血浆样本前处理有哪些注意事项？

由于cfDNA在血液中含量极低、片段短（通常为160~200 bp）、易降解，样本前处理环节对后续提取和检测结果影响极大。以下是关键注意事项：

（1）采样

建议使用专用采血管（如EDTA管、Streck管、Cell-Free DNA BCT管）防止DNA降解和细胞裂解，且尽量在2~4小时内完成血浆分离，避免白细胞破裂释放基因组DNA污染cfDNA。

（2）分离血浆

利用密度差异分离法，用离心机利用各成分比重差异实现分层:下层为红细胞，中层为白细胞和血小板(淡黄色薄层)，上层淡黄色液体即为血浆。最后小心吸取上清液即得血浆。注意操作时避免剧烈振荡，防止细胞破裂。

（3）血浆保存

分离后的血浆最好立即提取DNA。若需保存，应分装并冷冻于-80℃，避免反复冻融导致DNA降解。

三、血浆DNA提取出来测得的浓度很低是不是意味着提取失败？

不是哦！首先，血浆样本中游离核酸含量本就很低，根据某国际权威公司数据，1mL血浆样本DNA提取得率只有7.35ng左右（图1）。

其次，采用nanodrop等基于紫外分光光度计测得的浓度，实际上是很不准确的，因为这些样品中DNA含量过低，已经接近分光光度计的最低量程，且多次测量的结果会变异很大。因此可以把紫外读数作为参考，但是不能作为判断得率的唯一标准，最好还是要做个PCR或荧光定量（图2）。

四、如何提高血浆cfDNA提取得率呢？

1、提高样本量

根据Qiagen公司的实验结果表明，血浆用量与核酸提取量之间呈正相关关系。因此，为提高核酸得率，可适当增加血浆的起始体积。通常建议进行血浆核酸提取时，样本量不低于1 mL。若使用1 mL或更多血浆仍无法获得理想的检测结果，则应及时评估并更换提取试剂盒。

2、选择核酸吸附性能更好的吸附柱

研究者还可以通过选择对核酸吸附性能更好的吸附柱来提高cfDNA提取得率。市面上常用的几款血浆游离DNA提取试剂盒内吸附柱所配置的吸附膜厚度和品质具有一定差异，可优先选择采用进口化学修饰离子膜的品牌如Qiagen、BIOG的，进口膜虽然薄但是对游离核酸的吸附能力比普通国产膜更强，因此可最大化程度捕获更多的DNA，得率也就更高。