全内反射荧光显微术囊泡融合成像

　　图 1： 钙诱发融合事件的测量。使用载有磺胺-B 的囊泡的含量释放测定法测量钙触发的对接悬浮脂质双层囊泡的快速融合。磺酰蓼碱-B 在囊泡内集中时具有高度自淬灭性。融合后，染料被稀释，导致荧光明显增加。这种重构的测定方法概括了由突触 SNARE 蛋白驱动的囊泡融合，同时结合了关键的调节因子(包括突触蛋白、复合素、Munc18 和 Munc13)以精确控制融合的概率和动力学。使用 Teledyne Photometrics Kinetix 相机以每秒 500 帧的速度捕获荧光信号，提供大约 3 毫秒的时间分辨率。图表显示了 500 fps 下 SRB 融合动力学的荧光强度迹线。

　　背景

　　耶鲁大学神经病学系助理教授 Shyam Krishnakumar 博士领导了一项研究项目，重点是揭示控制神经元通讯的分子机制。“神经细胞通过释放称为神经递质的化合物进行交流——通常在一毫秒内，”他解释道。“我们的目标是了解所涉及的蛋白质成分，它们如何组装和发挥作用以支持这种超快的融合过程，以及如何调节它们的活性以满足生理需求。”

　　传统上，神经递质释放的研究依赖于动物模型或神经元培养物。虽然功能强大，但这些系统通常涉及多种蛋白质亚型和补偿机制，因此很难提取精确的机制见解。为了克服这些限制，Krishnakumar 博士的实验室开发了一种无细胞系统，该系统使用完全定义的最小成分在体外重建神经递质释放。“我们在一个有孔的硅芯片上构建了一个悬浮的脂质双层——模仿突触前膜——并跟踪模拟突触小泡的单个人工囊泡的对接和融合，”他说。“这种设置为我们提供了精确的实验控制，并使我们能够产生直接的机理见解。我们已经就该系统发表了大量论文，主要使用荧光显微镜在数十到数百毫秒的时间尺度上对聚变事件进行成像。

　　挑战

　　实验室面临的主要挑战是成像速度。“为了在生理时间尺度(大约 1 到 5 毫秒)上研究聚变，我们需要显着提高我们的时间分辨率，”Krishnakumar 博士解释道。“同时，我们需要一个大视野来跟踪多个囊泡，因为聚变事件的同步性是我们研究的一个重要方面。”

　　[Kinetix] 相机可以在我们重建的系统中进行高速记录，使我们能够分离和研究单个囊泡融合事件，并分析响应钙信号的释放同步性 - 所有这些都在接近生理的时间尺度上进行。------Shyam Krishnakumar博士

　　解决方案

　　为了应对这些成像挑战，Krishnakumar 博士采用了 Kinetix CMOS 相机，它将高速成像与低光水平下的出色灵敏度和大视场相结合，非常适合高放大倍率研究。“我们的合作者、伦敦大学学院神经病学研究所的 Kirill Volynski 教授多年来一直使用类似的设置，他向我推荐了 Kinetix，”Krishnakumar 博士说。“与我们的 TIRF 显微镜设置的集成是无缝的，在作上，它非常简单。我们没有遇到任何问题。

　　“Kinetix 相机为我们的工作带来了变革。我们现在能够以高时间精度执行所需的录音，“Krishnakumar 博士补充道。