神经环路应用（31）丨宽场荧光成像技术

宽场荧光成像（Wide-Field Fluorescence Microscopy, WF-Fluorescence）是一种广泛应用于生物学和医学研究中的显微成像技术。它通过激发样本中的荧光标记物并捕捉其发射的荧光信号来生成图像。

基本原理

1. 激发光源：通常使用汞灯、氙灯或LED作为激发光源，这些光源可以提供多种波长的光以适应不同的荧光染料。

2. 滤光片组：

激发滤光片：选择特定波长的光用于激发荧光标记物。

二向色镜：反射激发光并透过发射光，分离激发光与发射光。

发射滤光片：过滤掉未被荧光分子吸收并重新发射的背景光，只允许特定波长的荧光通过。

3. 探测器：通常使用CCD或CMOS相机捕捉荧光信号，并将其转换为数字图像。

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应用

1. 细胞生物学：观察细胞内部结构、蛋白质定位及动态过程。

2. 神经科学：研究神经元形态、突触连接及神经活动。

3. 病理学：检测组织切片中的特定分子标记物，辅助疾病诊断。

4. 药物开发：评估药物对细胞或组织的影响，筛选潜在药物。

Fig1 对 Thy1-YFPH 转基因小鼠脑切片进行宽场荧光成像，清晰分辨出神经元胞体及其轴突结构，验证了系统在固定样本中的高分辨率成像能力

进一步在活体实验中，利用470 nm激发波长进行Ca²⁺动态成像、561 nm进行形态学成像，成功同步记录了多达3804个表达GCaMP6f的神经元和4650个表达mCherry的星形胶质细胞。

该宽场显微镜具备多色兼容性、单细胞分辨率和高通量成像能力，不仅可清晰解析精细神经结构，还能高效捕获大规模细胞群体活动，显著提升目标感兴趣区域的快速定位与导航效率。

优势

成像速度快：一次曝光即可获取整个视场图像，无需逐点扫描，适合捕捉快速动态过程（如钙信号、神经活动）和进行长时间活体成像。

大视场覆盖：可同时观察毫米级范围内的数千个细胞，实现高通量、群体水平的分析，特别适用于全脑切片或大面积皮层成像。

系统结构简单、成本较低：相比共聚焦或双光子显微镜，宽场系统光学路径简洁，维护方便，设备成本和使用门槛更低。

多色兼容性强：通过切换滤光片组或使用多通道LED光源，可轻松实现多荧光标记的同时或交替成像（如GCaMP与mCherry）。

光毒性低、适合活体长期观测：激发光均匀照射，总光强通常低于点扫描技术，对活细胞损伤小，有利于维持样本生理状态。

易于与行为实验整合：轻量化设计和高速采集能力使其便于与动物行为装置结合，用于清醒动物的在体功能成像。

适用场景：大规模神经元活动记录、脑片结构成像、药物筛选、发育生物学动态追踪等。

局限

因缺乏光学切片能力，深层组织成像易受散射和背景荧光干扰，分辨率低于共聚焦或超分辨技术。

综上，宽场荧光成像是速度、通量与实用性之间高度平衡的技术，在需要“看得快、看得广”的研究中具有不可替代的优势。

文献引用：

• Wu R, Sun Y, Hao Z, Zhao C, Feng L, Wang A, Cheng H. Wide-field fluorescence navigation system for efficient miniature multiphoton imaging in freely behaving animals. Neurophotonics. 2025 Apr;12(2):025018. doi: 10.1117/1.NPh.12.2.025018. Epub 2025 Jun 27. PMID: 40584176; PMCID: PMC12204226.

• Huber D., et al. , “Multiple dynamic representations in the motor cortex during sensorimotor learning,” Nature 484, 473–478 (2012). 10.1038/nature11039

• Wu R., et al. , “A versatile miniature two-photon microscope enabling multicolor deep-brain imaging,” bioRxiv, 2025.2002.2013.635171 (2025).

• 16.Zhao C., et al. , “Miniature three-photon microscopy maximized for scattered fluorescence collection,” Nat. Methods 20, 617–622 (2023). 10.1038/s41592-023-01777-3

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