新型光片式荧光相关光谱-超分辨光学荧光成像

　　图 1：通过解卷积 A) 固定 2 µm 珠子和 B) 2 wt. 中动态 155 kDa 葡聚糖进行 3D 重建。使用 Kinetix22 sCMOS 相机获得的自制光片显微镜收集的数据，使用 3D 重建代码生成 % 琼脂糖凝胶。图片来自(Kramer 等人，2024)。

　　背景

　　Ambrose Swasey 副教授 Lydia Kisley 的研究兴趣是物理和化学的交叉领域，还结合了生物学和材料科学。 Kisley 教授解释了她最近的一些研究，“我们的一个项目专注于细胞外基质，我们正在采取自下而上的方法。我们将细胞培养到胶原蛋白凝胶中，旨在了解荧光分子或蛋白质如何在这种环境中扩散，以及细胞如何改变这种环境。”

　　“我们的方法是独特的，因为我们正在研究细胞外环境的空隙空间内的扩散，并且扩散速度很快。通过超分辨率技术，我们的目标是使用相关方法实现 100 nm 分辨率。我们预计，当细胞沉积材料并改变周围的环境时，它们将限制扩散速度，但这种速度会在细胞之间的空隙中增加。”

　　“我们的成像本质上是荧光相关光谱 (FCS) 与超分辨率光学涨落成像 (SOFI) 相结合。虽然 FCS 传统上是衍射限制的，但 SOFI 可以在宽视场中捕获超分辨率空间信息。我们还使用光片照明，因此我们的照明和检测途径非常新颖。”

　　图 2：具有双倒置光片照明的 FCS-SOFI 的光学设置和光路。该面包板以 90 度安装，以缩短光路。照明路径位于左侧，检测路径(显示 Kinetix22)位于右侧。

　　挑战

　　这种旨在快速、动态样本成像的技术组合带来了许多有趣的成像挑战，正如基斯利教授概述的那样，“我们假设细胞外环境中的扩散速率为每秒数十微米平方，这并不容易通过单分子跟踪捕获。我们必须在合理的长度范围内捕获这种快速扩散，而更传统的相机图像在超过 10 个像素左右时会显得模糊。此外，由于扩散速度快且帧速率高，因此曝光时间和信号水平非常低，背景上方只有 30 张照片。”

　　我还与讲师兼合作者 Stephanie Kramer 博士进行了交谈，“我们拥有独特的安装几何形状，其中面包板呈 90°，部分原因在于我们的倒置光片照明。我们使用两种不同的物镜进行照明和检测，并且我们仍然希望对生物样本进行成像。这提供了温和的照明，以减少整个样本的光漂白或光毒性，并提供 3D 切片功能。”

　　我们的方法的独特之处在于细胞外环境中的扩散非常快，而这正是 Kinetix22 至关重要的地方，我们看到了非常好的结果。------莉迪亚·基斯利教授

　　解决方案

　　Kinetix22 sCMOS 相机是这种独特应用的理想解决方案，可在大视场范围内提供极高的成像速度和高灵敏度。 Kisley 教授向我们讲述了她使用 Kinetix22 的经验，“我们需要在毫秒级的时间尺度上进行捕获以观察快速扩散，这就是我们研究 Kinetix 并购买 Kinetix22 的原因。它可以以每秒超过 10,000 帧的速度运行，因此我们在这些快速扩散事件中看到了非常好的数据。”

　　“Kinetix22 在高帧速率和高量子效率方面非常出色，因此我们可以获得足够的光子用于我们的相关技术，并收集有关细胞外环境内扩散的信息。即使在高放大倍率下，我们也可以使用 Kinetix22 捕获宽视场。”