5D全脑环路剖面分析的通用深度学习流程

D-LMBmapX: Generalised Deep Learning Pipeline for 5D Whole-brain Circuitry Profiling

5D全脑环路剖面分析的通用深度学习流程

https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.02.25.639766v2.full.pdf

摘要

理解全脑环路发育对于揭示与异常神经布线相关的疾病起源至关重要，但进展因缺乏用于精确、全面分析的工具而受限。大脑发育高度动态且具有区域特异性，在早期阶段个体间差异显著，且目前尚无任何现有方法能在任意发育阶段实现全脑剖面分析。发育中轴突形态的快速变化进一步加剧了分割的复杂性。在此，我们提出D-LMBmapX，一种用于自动化全脑环路剖面分析的深度学习流程，适用于整个出生后发育过程。D-LMBmapX通过相邻锚点阶段构建样本推断图谱，从而实现任意时间点的精确配准。通过开发用于泛化轴突和胞体分割的基础模型，它支持定量的介观尺度发育连接组学分析，并通过去甲肾上腺素能投射的空间-时间剖面分析得以验证。D-LMBmapX还实现了稳健的跨模态和跨维度配准，包括将单个2D切片精确对齐到3D参考图谱，并为多样化的生物医学空间数据集提供可推广的5D分析策略。

引言

深入了解神经连接是理解大脑功能组织方式的基础。在过去的几十年里，在绘制哺乳动物神经回路方面取得了巨大成功，特别是在介观尺度连接组学领域1–5。相关资源，包括高分辨率参考脑图谱，已迅速扩展6–10。组织透明化技术与光片荧光显微镜（LSFM）的结合，为高通量、全脑3D介观尺度连接映射开辟了显著机遇11–16。随着这些大规模数据集的激增，对相应分析工具的需求变得尤为迫切，为此我们开发了D-LMBmap，该工具采用深度学习算法进行全脑环路剖面分析，可在单一工作流中解决自动轴突分割、脑区分割和全脑3D配准问题17。

关键的是，在发育过程中绘制神经连接能够揭示成年网络如何建立，并为由异常布线引起的疾病提供必要的解剖学背景18,19。最近对成年和幼虫果蝇大脑的全脑连接组学分析表明，约0.5%的神经元存在发育性布线缺陷，由此提出了此类错位可能促成了个体差异和对精神健康障碍易感性的假说20。然而，与成人大脑相比，在发育中的哺乳动物大脑中绘制连接性面临着独特的挑战。在成人中，一个单一的时间点可以作为电路架构的稳定参考。相比之下，发育连接组学必须捕捉贯穿成熟过程的快速而连续的变化，需要跨越多个发育阶段进行时空映射，导致工作量增加了一个数量级以上。

在出生后的小鼠大脑中，结构稳定远未在P28之前达成21。在此期间，轴突纤维表现出多样且阶段特异性的形态，通常与成年大脑中所见有显著不同22。大脑发育在出生后早期高度动态且具有区域特异性，每个系统都在其自身的时间线上成熟。例如，躯体感觉皮层在P0左右接收丘脑皮质传入，到P3–P4时，桶状可塑性的关键窗口基本关闭，桶状凹陷和隔膜在P7时清晰界定。在听觉系统中，耳蜗和脑干成熟使听力在P10–P12左右开始。在视觉系统中，眼睛在P12–P14左右睁开，随后立即出现功能性视觉反应23。其他回路，如下丘脑系统，在出生后前两周内也经历快速的形态和突触变化24。为了准确捕捉这种回路动力学，全脑配准和轴突分割都必须在高时间分辨率下进行——理想情况下是在任意发育日进行。

此外，发育过程中显著的个体间变异性增加了这种复杂性。与成年大脑相比，发育中大脑的脑大小、结构组织和神经元形态变异更大。这种变异性在出生后早期阶段尤为明显，此时快速生长和发育时机上的微小差异即可产生明显的解剖学差异，即使在同窝仔中也是如此。环境因素——如营养、母体护理和微小的遗传变异——进一步放大了这些差异。

当前的方法需要近乎每日重复进行图谱构建、全脑配准和轴突分割，涉及大量人工输入。这使得工作量不切实际，并且由于发育变异性，仍可能导致准确性降低。此外，尽管3D全脑成像日益可用，许多环路剖面分析仍依赖于二维数据，包括连续切片法10,25–28、艾伦脑图谱等社区资源29以及传统组织学。要充分挖掘这些数据集的价值，需要将2D信息注册到3D框架中，以实现跨模态的整合与比较。

为应对这些挑战，我们开发了D-LMBmapX，这是一种用于在任意出生后阶段自动化全脑环路剖面分析的深度学习流程，通过适应个体样本的泛化模块提供精确、高效的分析。D-LMBmapX通过整合发育时间和多重信号集成，引入了动态的4D和5D能力。我们通过对全脑酪氨酸羟化酶（TH）阳性投射进行剖面分析来验证我们的方法，揭示了TH+神经支配在整个出生后发育过程中的区域特异性和动态模式。我们还实现了稳健且自动化的跨模态和跨维度配准，通过将艾伦研究所发育ISH数据集29中的基因定义神经元群体与我们的4D TH+胞体图谱对齐得以证明，并在一个统一的5D解剖-分子框架内使用多种标记物精炼神经元亚型分类。除小鼠大脑外，D-LMBmapX还为跨年龄、跨模态和跨维度的多重配准提供了可推广的策略，适用于多样化的生物医学数据集。

结果

发育性神经环路定量的综合框架

D-LMBmapX 由相互连接的模块组成，始于数据输入，最终在任意出生后阶段的3D样本推断图谱中实现自动化的轴突/胞体量化与可视化（5D，图1）。每个核心组件均由先进的深度神经网络（DNNs）驱动，可作为独立模块运行，或组合使用以实现自动化的5D全脑环路剖面分析，支持跨平台数据集的可靠比较。

利用一种新颖的配准方法，我们首先在七个锚点出生后阶段（P0、P4、P7、P10、P14、P21和P28）构建了高分辨率平均模板大脑。随后，通过将艾伦小鼠脑公共坐标框架（CCFv3）7依次配准到这些模板上，界定了分层的脑结构。为解决七个锚点图谱未覆盖的阶段，我们开发了一种样本推断图谱构建策略。该方法通过从相邻锚点阶段推断图谱，自适应地界定脑区，从而实现在任意出生后时间点的精确全脑配准（图1A）。为实现贯穿发育过程的全脑轴突和胞体剖面分析，我们开发了一个通用的基础模型CircuitFound，用于自动化分割，能够准确分割不同发育阶段间形态各异的轴突和胞体。结合全脑配准模型，这使得D-LMBmapX能够接受来自任意出生后大脑的输入，并输出注册到相应发育图谱上的区域特异性量化结果及轴突和胞体分布的3D可视化（图1B）。这个跨维度和跨模态模块支持通过相似性驱动的2D到3D空间对齐和配准，对2D组织切片进行端到端的定量分析——估算每张切片的姿态，通过可变形配准校正组织形变，并将定量信号映射到图谱坐标系中以进行区域分析（图1C）。

D-LMBmapX 将这些组件整合进一个用户友好的开源软件平台，支持通过高级应用程序编程接口（APIs）进行定制化，并包含一个图形界面，用于选择和执行预训练的深度学习模型（图1D）。

多约束非刚性4D脑图谱构建流程

为实现任意出生后阶段的全脑配准，我们首先为七个锚点阶段构建了高分辨率3D脑图谱。我们收集了从P0到P28的LSFM脑图像，每个阶段至少使用30个半脑来构建平均模板。为最大限度减少样本制备和成像带来的变异性，我们应用了一系列图像预处理策略，包括N4偏场校正30、强度重标定和3D自适应直方图均衡化31。对于每个阶段，我们通过对所有大脑进行配准至共同中心并计算体素级平均值，创建初始参考模板（图2A）。虽然我们整合了传统的图谱构建流程32,33——其中包括刚性、仿射和B样条配准——但我们进一步使用一种定制的2.5D非刚性配准方法对模板进行了精炼。该方法使用基于U-Net的神经网络在冠状面和水平面上执行2D配准。然后，我们将每个视图的3D配准结果组装起来，并计算3D一致性损失以指导迭代精炼。这一过程允许每个大脑在共享的形变空间内更新模板，从而生成高分辨率、精细的参考模板（图2B）。

在为每个发育阶段建立了精细的脑模板后，我们的下一个挑战是为每个阶段界定数百个脑区。在此规模下进行手动标注极其耗费人力，因此我们开发了一个用于图谱映射的自动化流程。

并利用跨阶段和跨模态配准进行构建（图2C）。我们首先将成年小鼠脑图谱（艾伦CCFv3）配准到我们的P28脑模板。此过程结合了脑风格迁移、多约束配准17以及我们的2.5D非刚性配准方法。具体而言，我们开发了一种基于扩散的脑风格迁移方法，将处于STPT模态的艾伦CCFv3图像转换为LSFM模态。我们通过自动标注六个主要脑区并手动标注八个较小区域，创建了多个脑结构约束（图S1A）。这种多约束策略缓解了在传播脑区界定过程中出现的配准偏移和误差累积问题（图S1B）。在完成从艾伦CCFv3到P28模板的跨模态和跨阶段配准后，该流程自动界定了数百个脑区。随后，我们通过顺序配准——P28到P21，P21到P14，依此类推——将这些标注传播到更早的阶段，最终构建出覆盖全部七个出生后阶段的完整图谱系列（图2D，图S2）。

为评估我们4D脑图谱构建流程的有效性并评估所得D-LMBmapX图谱的准确性，我们进行了一系列与现有方法和参考图谱的对比分析。我们首先将我们的全脑配准流程与ANTs34这一广泛使用的非刚性配准方法进行基准测试，后者也被用于构建DevCCF图谱32。在完成配准后，我们在整个大脑范围内计算了区域级Dice分数，以评估解剖学配准精度。为确保公平比较，我们在两种流程中均采用了相同的预处理步骤。我们的结果表明，D-LMBmapX在多个脑区始终获得更高的Dice分数，表明我们的2.5D非刚性配准方法性能更优（图S1C）。接着，我们通过将D-LMBmapX构建的图谱与两个领先的发育脑图谱——DevCCF32和DeMBA35——进行比较，评估了其准确性。由于这些图谱最初采用不同的配准策略构建，我们使用相同的D-LMBmapX配准流程将独立的脑样本重新注册到每个图谱，以确保公平比较。由于DevCCF和DeMBA35并未涵盖D-LMBmapX中可用的所有出生后阶段，我们将评估范围限定在三个图谱共有的阶段。对于DeMBA35，仅纳入真实的（真实样本）图谱进行分析，排除了其插值（合成）图谱。随后，区域级Dice分数被用于评估解剖学对应关系，D-LMBmapX显示出持续更高的解剖学对应性（图2E，图S3）。

综上所述，这些结果验证了我们的多约束非刚性流程在全脑配准方面的有效性，并证明D-LMBmapX能生成高精度的4D脑图谱，能够捕捉发育动力学，且在解剖学精度上优于现有资源。

接下来，我们表征了跨越七个出生后阶段的全脑和区域层面的发育体积变化（图2F和G，表S6）。在全脑层面，总体积稳步增加，其中P0至P7之间增长最快（图2G）。在区域层面，276个区域被分为13个主要脑区，显示出独特且动态的发育轨迹（图2F）。皮质和海马区域、纹状体和小脑大体上表现出单调增长，尽管皮质亚区有所差异：无颗粒岛叶皮层（AI）在P7时达到平台期，初级运动皮层（MOp）在P14时达到峰值，眶额皮层（ORB）在P21时达到峰值（图2G）。相比之下，丘脑区域在P14左右达到峰值，而其他主要脑群则表现出更异质、阶段特异性的变化模式（图2F）。

这些发现强调，大脑成熟是非线性和区域性不同步的，不同脑区经历着独特的发育轨迹，并在不同的出生后时间点达到关键里程碑——其中一些可能落在本文所描绘的七个锚点阶段之外。这种生物学复杂性要求在任意出生后日期进行全脑配准，以确保解剖学准确性。然而，DeMBA35中使用的基于插值的策略，通过假设相邻时间点之间的脑发育平滑且均匀来生成中间阶段图谱，未能考虑到这些区域特异性的动态变化。因此，此类插值图谱可能会引入解剖学不准确性，尤其是在快速或异质性发育时期。

任意时间点的样本推断全脑配准

为实现在任意出生后阶段的精确全脑配准，我们开发了一种流程，该流程通过将待研究的脑样本与其相邻发育阶段的图谱相结合来构建样本推断图谱（图3A）。为演示该流程，我们以P10大脑为例，从其相邻阶段（P7和P14）构建一个样本推断的P10图谱。首先，将P7和P14图谱注册到P10大脑图像上，在保留其原始解剖标签的同时生成两个形变后的图谱，形成一个类似P10的空间。随后，这两个类似P10的图谱按体素进行平均，形成一个整合了两侧阶段解剖特征的初始参考模板。接着，根据图2A所示的图谱构建流程，这两个类似P10的图谱被迭代注册到该初始平均模板上，从而产生一个经过精炼、具有更高解剖一致性的样本推断P10图谱（图S4A）。接下来，为界定脑样本，原始P10大脑被注册到此样本推断图谱上，并转移所有解剖标签。为进一步提升配准的可靠性和通用性，我们设计了一个基于互学习的配准框架，该框架能自动识别可靠的解剖约束。具体而言，显示出两个来源（类似P10的P7图谱和类似P10的P14图谱）之间强空间对应关系的脑区被自动选择并用作约束，以指导从原始P10大脑到样本推断图谱的配准。在此，两个2.5D配准模型分别基于所选脑区交集和并集的约束进行互训练（图S4B）。

该策略利用了可靠对齐的脑区作为空间约束，从而提升了整个大脑的配准性能（图S4C）。重要的是，所有脑区约束——包括主要和次要区域——均是自动获得的，无需任何手动标注。为评估样本推断图谱与真实P10图谱之间的相似性（图3B），我们将P10脑样本分别注册到两者以及相邻阶段图谱（P7和P14）。Dice分数分析显示，对于主要或次要脑区，样本推断图谱与真实P10图谱在配准精度上无显著差异，而注册到P7或P14则导致显著更低的精度（图3C）。当使用P7作为推断阶段时，也获得了可比的结果（图S5A & B）。接下来，我们比较了将P10脑样本配准到DeMBA插值的P10图谱与配准到我们的样本推断P10图谱的配准性能。Dice分数分析表明，注册到我们的图谱在全局和各个独立脑区层面均表现出更优的精度（图3D & E）。

综合来看，这些结果证明了我们的样本推断全脑配准流程能够在任意出生后日期实现精确配准。由此生成的样本推断图谱所达到的配准精度与真实图谱相当，并显著优于插值替代方案。

用于样本推断4D图谱生成与配准的通用流程

我们的样本推断配准流程不仅适用于发育中的小鼠大脑，

还支持对人类胎儿和婴儿数据集进行4D分析。对于一个29周的胎儿大脑和一个7个月大的婴儿大脑，我们通过将样本本身与其相邻阶段的图谱（例如，23周和35周，或4个月和10个月）整合，生成了样本推断图谱。随后，每个大脑都被注册到其自身的样本推断图谱、相应的真值图谱以及相邻阶段的图谱。Dice分数分析显示，注册到样本推断图谱的精度与注册到真值图谱的精度相当，并显著优于相邻阶段配准的精度（图3F & 图S6）。

由通用基础模型实现的5D全脑环路剖面分析

全脑环路剖面分析要求深度学习模型能够有效分割神经结构（如轴突和胞体），这些模型需在大量且标注良好的样本上进行训练。为消除耗时费力的手动轴突标注，我们此前已开发了自动化标注和数据增强策略17。然而，神经结构，特别是轴突投射，在发育过程中经历显著的形态变化。这种形态多样性对跨阶段稳健的环路剖面分析构成了重大挑战。在单一阶段上训练的分割模块往往无法泛化，且为每个阶段训练新模型在时间和资源上成本过高。为应对这一挑战，我们开发了CircuitFound，这是一个集成到D-LMBmapX中的通用基础模型，用于轴突和胞体分割，能有效适应多样的神经形态和脑图像（图4）。

CircuitFound的构建包含三个步骤：自监督预训练、自动化样本标注和微调。超过100,000个3D立方体从跨越七个出生后阶段的抗TH染色LSFM脑样本中随机裁剪出来，用于由3D掩码自编码器（MAE）进行的自监督预训练。视觉变换器（ViT）36编码器嵌入未掩码的块，与仅依赖像素级重建的传统MAE不同，我们引入了一个第二解码器分支来重建有向梯度直方图（HOG）38（图4A）。这种双解码器设计使模型能够捕捉通用图像特征和基于梯度的结构线索，使其能更好地表征对精确分割至关重要的轴突长程、树状形态。消融研究结果支持了我们在预训练中策略的有效性（图S7A）。

许多神经系统，如多巴胺能系统，其胞体分布于多个脑区而非局限于单一核团。因此，为准确重建环路，分割必须区分胞体信号和轴突投射，因为混淆二者可能导致连接性的误判。因此，CircuitFound被设计为同时刻画轴突和胞体，预训练后两者均可自动标注。我们采用了之前在D-LMBmap中报道的方法进行轴突标注，并基于“分割任意模型”（SAM）39开发了一个新的3D胞体标注流程。在此流程中，唯一的手动输入是在少数2D切片中为每个胞体提供一个点提示；SAM随后会自动根据这些提示分割胞体。为进一步分离粘连的胞体，我们引入了一种基于距离图的分水岭算法（图4B）。这种轻量级策略使得多样化的轴突和胞体分割任务能够高效且可扩展地进行标注。最后，我们使用标注的立方体对预训练的基础模型进行了微调。由于直接微调ViT编码器因参数量大而效率低下且需要大量数据，我们通过引入一个并行的卷积神经网络（CNN）解决了这一问题。在每一层，ViT编码器的输出都与相应的CNN输出融合，从而实现了更快的收敛和更高的精度（图4C）。通过并行ViT和CNN，我们的框架仅需少量标注样本即可实现对轴突和胞体的鲁棒全脑预测。

配备了CircuitFound模块，D-LMBmapX在轴突和胞体分割方面展现出强大的泛化能力。为展示其在跨脑区和跨发育阶段全脑环路剖面分析中的有效性，我们将其应用于表征七个出生后阶段的去甲肾上腺素能回路。来自P0、P4、P7、P10、P14、P21和P28小鼠的大脑经整体免疫组织化学、iDISCO组织透明化处理和LSFM成像处理。我们使用酪氨酸羟化酶（TH）免疫染色标记多巴胺能和去甲肾上腺素能神经元及其轴突投射。D-LMBmapX成功分割了这些标记结构，将每个大脑注册到其对应的发育阶段图谱，并计算了每个阶段TH+轴突和胞体的密度图（图4D，图S8，视频S1-3）。与传统的深度模型如TrailMap12、D-LMBmap40和ACE41相比，D-LMBmapX无需针对单个阶段进行样本训练。此外，D-LMBmapX取得了更优的性能，尤其是在使用较少标注样本时（图S7B）。在轴突分割方面，D-LMBmapX在CI Dice、CI Precision、CI Recall和Dice分数上始终优于TrailMap，覆盖不同脑区和整个大脑的平均值（图4E和图S7C）。在胞体分割方面，D-LMBmapX在Dice和Precision分数上显著优于ACE，后者是目前最先进的神经细胞体映射流程（图4F）。

使用D-LMBmapX，我们量化了跨越13个主要脑区的260多个脑区的TH+轴突密度，并生成了产后轴突支配的4D图谱（图4G，表S6，视频S2&3）。该分析揭示了高度异质性、区域特异性的TH+支配模式。在同皮质和嗅觉区域，轴突密度随时间普遍增加，而其他区域则表现出显著的时空动态（图4G–H）。这包括在特定发育阶段的急剧增加（例如，NTS）、瞬时峰值（例如，PVH和BST）、从出生起的稳定水平，甚至渐进性下降（图4H，图S9）。据我们所知，这是首个TH+轴突支配的4D全脑图谱。值得注意的是，轴突密度的下降无法完全由区域体积变化解释，暗示了轴突修剪的贡献（图S9）。

通用的跨维度与跨模态配准

尽管3D全脑成像正被越来越多地采用，但大量可用的环路剖面数据仍为二维。这包括以连续切片方式获取数据的先进成像技术、主要社区资源（如艾伦脑图谱），以及许多神经科学实验室中广泛使用的2D组织学。为确保更广泛的神经科学界能充分受益于多样化的连接性映射资源并实现跨平台数据比较，我们在D-LMBmapX中开发了跨维度和跨模态配准功能。

跨维度和跨模态配准流程包括切片预处理、跨模态风格迁移、空间对齐以在3D参考图谱中识别最佳匹配切片，以及最终的2D到3D配准（图5A）。此前，我们开发了首个基于CycleGAN的脑特异性风格迁移方法，该方法学习不同成像模态间的无监督映射17。然而，这种方法每当引入新的模态时都需要从头重新训练模型。为获得更具泛化性和一致性的跨模态风格迁移，我们开发了一种基于扩散模型的新方案，该方案可将源脑图像模态转换为任意给定的目标风格（图S10A）。在训练过程中，仅使用目标脑图像。每张图像通过逐步添加噪声直至其无法与随机噪声区分来进行渐进式降级。随后，模型通过去噪过程学习重建原始目标图像。

为提升稳定性和准确性，我们整合了两个模块：(i) 脑边缘约束，确保重建图像中的结构边界与输入保持一致；(ii) 一个去噪U-Net，用于分割主要脑区（BS, CB, CTX, HPF, CP, OLF），以保留区域边界。在预测步骤中，来自其他模态的源大脑通过训练好的模型转换为目标风格，并利用源图像的结构边缘引导重建，以维持解剖细节。这种基于扩散的方法具有两大主要优势：它在不同模态间保留了边缘和精细细节，并且对于给定的目标模态只需训练一次，而与源模态无关。基准比较表明，D-LMBmapX在脑风格迁移方面表现优异，包括从LSFM到STPT（艾伦CCFv3）以及从艾伦组织学2D切片到我们的发育LSFM脑图谱的转换（图S10B & C）。

在经过预处理和风格迁移以匹配目标3D脑模态后，每张2D切片均通过我们新开发的模块自动定位并注册到3D图谱中（图5B）。使用Harris角点检测器42自动检测2D切片和3D图谱每个正交切面（例如，矢状面）上的标志点，并用尺度不变特征变换（SIFT）43特征进行描述。根据匹配标志点的数量，识别出K个最相似的正交切面，并应用随机抽样一致性（RANSAC）算法44来估计将2D切片与这些候选切面对齐的最佳初始旋转角度。为进一步精炼配准，D-LMBmapX在估计的方位周围进行细粒度搜索，通过改变偏航角和滚转角，根据互信息相似性选择最佳匹配切片。为评估定位精度，我们对2D切片施加受控的旋转和平移扰动，然后使用D-LMBmapX将其配准到3D图谱。结果在偏航角、滚转角和平移方向上均显示出低误差，证实了我们流程在可靠2D到3D配准方面的稳健性和精确性（图5C）。

为证明D-LMBmapX能够实现系统性环路剖面分析所需的精确2D到3D全脑配准，我们表征并注册了与去甲肾上腺素能系统相关的标记基因表达。我们首先比较了P4、P14和P28时艾伦2D原位杂交（ISH）切片与抗TH染色的3D LSFM大脑之间的Th+胞体密度（图5D，图S11）。在包含多巴胺能或去甲肾上腺素能神经元的16个脑区中，标准化后的区域级Th+胞体密度在两组数据集中高度对齐（图5E）。接下来，为进一步通过整合2D分子特征与3D解剖结构来精炼细胞类型表征，我们针对三个基因标记物——Th、Slc6a2 和 Slc6a3——在P4、P14和P28时，对涵盖腹侧被盖区（VTA）和蓝斑核（LC）的单个艾伦2D ISH切片进行了剖面分析和注册。由D-LMBmapX生成的胞体密度热图准确地定位了VTA中的多巴胺能神经元（Th+, Slc6a2−, Slc6a3+）和LC中的去甲肾上腺素能神经元（Th+, Slc6a2+, Slc6a3−）45（图5F，图S12）。综上所述，这些结果表明，D-LMBmapX能够将单个2D组织学切片精确地放置在3D图谱中，即使在成像位置、旋转或形变存在差异，甚至没有连续的系列切片的情况下，也能稳健地匹配它们。据我们所知，这代表了首个实现自动化跨维度和跨模态全脑配准的工作流，为整合多样化的生物医学空间图像提供了一个通用框架。

介观尺度连接组学的迅速兴起，加之机器学习的进步，加速了将环路和多组学数据注册到标准化脑图谱的趋势。然而，与为成年大脑日益丰富的工具和资源46–51相比，针对发育中大脑的等效资源仍然稀缺。在此，我们提出了

D-LMBmapX，一个用于在出生后发育过程中对小鼠脑环路进行5D映射的端到端深度学习系统。D-LMBmapX包含自动化工具，可实现跨所有出生后阶段的全脑配准及胞体/轴突分割，从而支持发育连接组学的高效且稳健的定量分析。它还提供了跨时间、空间和模态领域的通用分割与配准策略，支持可扩展且多功能的应用于广泛的生物医学数据集。

我们开发了一种定制的2.5D非刚性配准策略，该策略能够在单个样本与3D参考图谱之间实现精确的全脑配准，从而促进了锚点阶段图谱的高效构建。与典型的基于3D深度学习的方法不同，我们的2.5D配准方法在不产生高昂计算成本的情况下实现了精确、高分辨率的3D配准。该策略易于扩展至更高分辨率的图像，使其在多样化的数据集中具有更广泛的应用性。将其嵌入D-LMBmapX后，我们构建了七个锚点阶段图谱，并量化了出生后发育过程中267个脑区的体积变化。这揭示了各区域间高度多样化和动态的增长模式（图2），凸显了亟需一种能够稳健地在任意时间点注册发育中大脑的方法，以支持广泛的神经发育研究。

然而，在每个发育阶段实现全脑配准需要重复构建图谱，涉及大量的样本收集和细致的分割工作。除了繁重的工作量外，早期出生后阶段引入了显著的变异性——即使是在同龄样本中——使得精确配准尤其具有挑战性且易出错。作为一种权宜之计，现有策略35通常依赖插值图谱来填补未代表的时间点，但其背后假设的大脑成熟过程平滑线性的前提引入了重大局限性，并削弱了原始目标。大脑发育本质上是非线性和区域特异性的，不同的回路在不同的时间线上成熟，并在关键时期经历快速的形态变化。对相邻年龄模板进行线性变换和平均——而不考虑这些生物学动力学——可能会导致解剖学上不准确的插值图谱，尤其是在经历剧烈结构或位置变化的区域。此外，对整个大脑应用统一的变换无法捕捉不同区域异步发育的特点，可能扭曲关键的神经解剖学特征。这些局限性强调了基于真实样本的数据驱动型图谱构建的必要性，特别是在发育轨迹最发散的早期出生后阶段。

D-LMBmapX通过使用户能够仅凭单一样本及其相邻锚点图谱，自动构建任意给定出生后日期的推断图谱，从而应对了这一挑战，赋予发育神经科学界一项基础工具，使其能够根据自身关键时间线研究感兴趣的脑区，而非受制于图谱的可用性。

对于介观尺度环路剖面分析而言，全脑轴突和胞体分割通常是耗时最长的步骤。尽管我们此前已开发了D-LMBmap17，这是一个用于全脑环路剖面分析的自动化流程，大幅减少了对劳动密集型手动标注的需求，但它仅设计用于成年阶段。直接将D-LMBmap17扩展至5D发育分析会面临重大挑战，因为发育过程中轴突和胞体形态存在显著变异，这将要求拥有大量标注数据集并在每个出生后阶段重新训练模型。为克服这一难题，D-LMBmapX整合了CircuitFound，这是一个强大的基础模型，能够在海量脑图像数据集上实现大规模自监督预训练。只需极少的样本特异性微调，该框架即可实现跨发育阶段的稳健而精确的轴突和

胞体分割，为全面的脑绘图提供了一个通用解决方案。

介观尺度连接组学的快速进步由大规模3D成像技术（如LSFM）和多种高分辨率2D方法25–28共同推动。与此同时，对整合多模态、高通量空间数据集以捕捉大脑组织互补方面的日益增长的需求也不断涌现。这些数据集包括空间转录组学、跨突触示踪、活动依赖性标记和功能成像等。然而，由于这些程序的复杂性，此类数据集通常仅限于少量经过处理的2D脑切片。现有的2D到3D配准方法通常需要多个连续切片，且受限于有限的分辨率52,53。在此背景下，D-LMBmapX代表着一项重大进展——其执行跨模态和跨维度配准的能力，允许即使是单个2D切片也能在共同的3D参考框架内被精确对齐。这种集成能力不仅增强了介观尺度环路剖面分析的可扩展性，也为构建一个融合解剖、分子、生理和功能数据的统一介观尺度连接组学生态系统奠定了基础。

前脑TH+环路主要由多巴胺能和去甲肾上腺素能系统组成，这两个关键的神经调节系统参与广泛的功能，包括奖赏、动机、注意力和情绪调节。这些系统中的发育缺陷长期以来被认为与多种精神障碍的易感性有关54,55。通过使用D-LMBmapX，我们生成了首个覆盖出生后发育过程中260多个脑区的TH+轴突支配的5D全脑图谱。虽然纹状体从P0起就接受极其密集的支配，且当前成像分辨率下无法在轴突水平进行分割，但我们通过强度对其区域密度进行了量化，以确保全面覆盖。在皮质区域，TH+轴突密度随时间稳步增加，这与青春期期间前额叶皮层投射的多巴胺能轴突持续生长和路径形成报告一致56。相比之下，其他区域表现出多样的时空动态，包括急剧的发育激增、瞬时峰值（例如，PVH和BST），或无法归因于脑体积变化的渐进性下降——这些模式与多巴胺支配系统层面精细化的证据相符57。我们的图谱为这些系统提供了全脑范围的发育参考，并为探索区域特异性支配轨迹如何与神经发育和心理健康状况的脆弱窗口相关联奠定了基础。对TH+轴突的成功全脑剖面分析凸显了D-LMBmapX作为一个有效的端到端工作流在介观尺度环路分析中的作用，能够实现精确的解剖映射、发育轨迹追踪和跨研究比较。

D-LMBmapX标志着从静态映射向动态、综合脑绘图的转变，实现了对不同神经环路和神经发育障碍发育组装的自动化、精确分析。除发育中的小鼠大脑外，它还提供了一种强大且可推广的5D策略，用于通过整合空间、时间和多组学分析来研究生长、衰老和疾病。

原文链接：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2025.02.25.639766v2.full.pdf