Nature | 别构调控配体改变GPCR对G蛋白选择性的分子机制

撰文|存中一贯

GPCRs是最大的药物靶点家族，约有三分之一的上市药物作用于GPCR靶点受体。GPCR主要通过偶联多种G蛋白或者β-arrestins等信号转导蛋白（transducers）来介导不同的生理效应，这些效应或者具有治疗益处，或者产生不良反应。需要注意的是，同一个受体在不同的配体刺激下会偶联不同的信号转导蛋白（G蛋白或者β-arrestins）并导致不同的生理效应，这被称为功能选择性或者偏向性信号（biased signaling）转导【1,2】。

偏向性信号转导在30多年前已被发现，然而，偏向性化合物至今大多未能实现其预期潜力，主要原因在于偏向性激动的分子基础尚不明确【3-5】，使得基于结构的药物设计难以推进。

近日，来自美国明尼苏达大学双城分校的Lauren M. Slosky带领团队在Nature杂志发表了文章

Designing allosteric modulators to change GPCR G protein subtype selectivity

为了验证和检测上述假设，研究人员以神经降压素受体1（NTSR1）为模版进行了详细的机制检测。NTSR1是一个治疗精神分裂、癌症、药物成瘾和疼痛的潜在靶点，其全激动剂会激活多种G蛋白亚型，但同时会产生低温反应等副作用。此前研究人员发现了NTSR1的一个偏向性激动剂SBI-553，它能够偏向性激活NTSR1下游的β-arrestins信号通路，而不激活Gq信号通路。SBI-553能够减轻成瘾等相关行为并缓解疼痛，且不会产生全激动剂带来的副作用。

为了探究NTSR1的激活机制，研究人员选择了4种配体，包括内源配体神经降压素（neurotensin,NT）、NT的活性片段PD149163、SBI-553以及NTSR1的拮抗剂SR142948A。通过荧光能量共振转移实验（FRET），研究人员对4种配体介导的NTSR1对下游14种Gα蛋白（Gq、G11、G15、Gi1、Gi2、Gi3、GoA、GoB、Gz、Gg、G12、G13、GsS、GsL）以及2种β-arrestins（β-arrestin 1和β-arrestin 2）的激活进行了筛选和检测。结果显示，NT能够激活12种G蛋白信号通路，唯一不激活的是Gs亚家族两个G蛋白信号通路，其最强激活的是Gq/11亚家族的G蛋白信号通路。PD149163的激活能力较差，仅激活Gq/11蛋白及部分Gi/o蛋白信号通路。拮抗剂SR142948A不激活任何下游信号通路。SBI-553不激活Gq和G11，但能微弱激活G15、Gi1、Gi2、GoA、GoB、Gg、G12和G13。对于β-arrestins的招募，三个配体都能诱导两种β-arrestins的招募，拮抗剂则同样无效（图1）。上述实验结果表明，SBI-553是NTSR1下游G蛋白信号通路的弱激动剂。

图1 不同配体对NTSR1的激活

进一步，研究人员探究了拮抗剂以及SBI-553分别与NT联用的效果，SR142948A作为一种竞争性拮抗剂，能够完全抑制NT对NTSR1的激活，包括所有的G蛋白和β-arrestins。而SBI-553与NT联用后产生了不同的效应，SBI-553完全抑制了NT对Gq和G11的激活，部分拮抗了一些G蛋白信号通路（Gi1、Gi2、Gi3和Gz），对另外一部分G蛋白信号没有拮抗效果（GoA、GoB、G12和G13）。

SBI-553拮抗NT诱导的G蛋白激活，可能通过抑制NTSR1-G蛋白复合物形成或者诱导β-arrestins招募，占据NTSR1结合核心区域，阻止G蛋白结合。研究人员对此进行了检测，发现利用Mini-G蛋白进行BRET实验同样证实了SBI-553能够抑制NT对Gq信号通路的激活，而敲除β-arrestins对SBI-553的作用没有影响，说明SBI-553发挥的作用不依赖于β-arrestins，而是直接抑制了NTSR1-G蛋白复合物的形成。

Gα亚基与GPCR分子内核心的结合主要通过其高度可变的C端，为了继续探究SBI-553拮抗NTSR1-Gq/11的分子机制，研究人员构建了多种融合蛋白，分别将不同G蛋白的C端进行替换，比如当Gq的C端被GoA的C端替换之后，SBI-553对Gq的抑制活力减弱，说明G蛋白的C端对于SBI-553的选择性具有重要影响。进一步，研究人员筛选到了Gq/11的C端中4个关键氨基酸，但将这4个氨基酸替换为GoA中相应的氨基酸后并没有影响SBI-553对其的拮抗作用，这与设想的并不一致。

为了解释这种现象，研究人员分析了NTSR1-NT与不同G蛋白的复合物结构。在SBI-553不存在的情况下，与NTSR1结合的GoA和Gq蛋白的C末端呈现“闭合”的α螺旋状态。对这些结构进行叠合分析显示，GoA与Gq的C末端在受体核心区域内几乎完全重叠。若将SBI-553对接至结合位点，会与GoA和Gq产生空间位阻。不过，当SBI-553存在时，GoA的C末端采取了一种浅结合态的“开放”构象：其Go螺旋项TM1倾斜14°，并在末端5个残基处发生轻微解旋，导致其向受体核心区域的嵌入深度减少4埃，同时，在此“开放”构象中，GoA与SBI-553的羟基侧链、quinazoline C8以及氟原子产生范德华力，稳定了复合物结构。

对蛋白质数据库的分析显示，GoA的“开放”构象具有独特性，NTSR1-Gq复合物结构无法实现这种结构微调。通过计算机同源建模，将其它G蛋白的C末端13个残基替换GoA的对应片段，发现一些G蛋白的C末端能够采取替代性浅结合构象，并与SBI-553产生有效的范德华作用，进一步增强了复合物稳定性，而部分G蛋白则在能量上不利于结合，这是SBI-553介导NTSR1偏向性信号的结构基础。

基于上述分子机制，研究人员进行了偏向性别构调节剂（biased allosteric modulators,BAMs）研究，旨在探究通过结构修饰能否改变SBI-553的G蛋白选择性。研究人员重点关注与G蛋白C末端存在相互作用的位点修饰，共设计了29个SBI-553的类似物，通过BRET实验检测了它们对NT诱导的NTSR1激活进行了检测。结果显示，这些化合物大多依然能够激活β-arrestins，一些微小的修饰改变了SBI-553对G蛋白的选择性。其中，化合物SBI-342能够减弱NT诱导的GoA激活，相比SBI-553，它对Gq的拮抗效力也减弱了。类似物SBI-593表现出了完全不同的G蛋白选择性，它仅对Gq发挥部分拮抗效力，同时保留了对β-arrestins的激活能力，对其它G蛋白信号通路没有影响（图2）。

图2 SBI-553类似物对G蛋白的选择性差异

最后，研究人员在体内生理实验中检测了不同化合物的生理功能与期信号转导之间的联系。研究人员在大鼠和小鼠体内构建了NT和PD149163诱导的体温降低模型，在此模型中NTSR1下游Gq/11信号通路发挥了关键作用。通过腹腔分别注射SBI-553和SBI-593，研究人员发现，SBI-553能够抑制PD149163引起的小鼠体温过低症状，而SBI-593则不能，进一步验证了SBI-593中，微小修饰带来的偏向性信号改变引发的生理功能改变。

总之，本研究探索了化学小分子配体介导GPCR偶联下游效应蛋白的分子和结构机制，通过化学修饰能够改变化合物在GPCR内部的结合位点，改变其结合不同G蛋白的能力，为GPCR偏向性配体的设计与开发提供了新的理论基础。

https://doi.org/10.1038/s41586-025-09643-2

制版人： 十一

参考文献

1. Kolb, P. et al. Community guidelines for GPCR ligand bias: IUPHAR review 32. Br. J. Pharmacol. 179, 3651–3674 (2022).

2. Slosky, L. M., Caron, M. G. & Barak, L. S. Biased allosteric modulators: new frontiers in GPCR drug discovery. Trends Pharmacol. Sci. 42, 283–299 (2021).

3. Wingler, L. M. et al. Angiotensin and biased analogs induce structurally distinct active conformations within a GPCR. Science 367, 888–892 (2020).

4. He, F. et al. Allosteric modulation and G-protein selectivity of the Ca2+-sensing receptor. Nature 626, 1141–1148 (2024).

5. Sachdev, S., Creemer, B. A., Gardella, T. J. & Cheloha, R. W. Highly biased agonism for GPCR ligands via nanobody tethering. Nat. Commun. 15, 4687 (2024).

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