高效快捷Line REscan AION 及 Kinetix 解决方案

　　图 1： Line REscan AION 共聚焦显微镜配备两台 Kinetix sCMOS 相机，用于多色成像，在 3k x 3k 像素阵列上的速度超过 100 fps。

　　Line RE扫描 AION 共聚焦系统和 Kinetix 相机的结合为活细胞成像提供了无与伦比的功能。AION具有电动可切换针孔，可为具有大视野的各种物镜提供精确的共聚焦。Kinetix 提供无与伦比的灵敏度和速度，量子效率 (QE) 高于 95%。这种组合非常适合活细胞成像，因为它能够对大样品进行高速图像采集，并通过实时反卷积和降低光毒性来增强。这种适应性强且用户友好的系统支持同步双相机成像，并与显微镜机身和软件无缝集成，在共聚焦显微镜中提供前所未有的性能。

　　介绍

　　现代显微镜是突破生命科学领域人类知识界限的重要工具，随着硬件或软件的每一次新发展，它都会向前迈进一步。转盘共聚焦显微镜是生命科学领域一种流行的成像方法，因为光学切片可在单焦平面内提供更高的分辨率和更清晰的图像。然而，活细胞转盘共聚焦显微镜面临局限性，需要更温和的成像，具有更高的分辨率、更高的采集速率、更高的光谱灵敏度、更大的视场 (FOV) 等。

　　Confocal NL 的 Line RE扫描 AION 共聚焦装置提出了一个颠覆性的概念，可在紧凑且经济高效的解决方案中实现高分辨率成像。任何成像设置的关键部分是探测器，Teledyne Photometrics 的 Kinetix 是一款突破性的现代背照式 sCMOS 相机，在速度和灵敏度之间取得了平衡，同时为大 FOV 成像提供了最大的商用传感器之一。

　　在本文中，我们旨在强调这两种技术的强大集成，强调它们为显微镜提供的独特优势。其结果是一种工程解决方案，能够在大视场范围内同时在多达两个探测器上进行高速成像，所有这些都具有最先进的共聚焦系统的分辨率和轴向切片。

　　新设置超越的限制

　　典型的sCMOS相机通常缺乏必须在高速下检测微弱信号的应用所需的灵敏度和采集速度。使用 Kinetix 可实现两倍以上的采集速度，并且从可见光到近红外 (NIR) 波长的 >95% 的高 QE 和最小的噪声水平(< 1 e-read 噪声)缓解了以前探测器遇到的瓶颈。Kinetix 传感器(3200 x 3200 像素，6.5 μm 像素尺寸)在选择放大设置和其他成像模式时提供了灵活性。该芯片的物理尺寸(对角线为 29.42 毫米，即 FN29)在每一帧中捕获的数据比典型的 sCMOS 相机多得多，但需要与适当的大 FOV 系统配对，以最大限度地发挥大型传感器的优势。

　　AION 已针对大型样品进行成像进行了优化，并充分利用了 Kinetix 提供的大 FOV 和分辨率，从而提供了传统系统两倍以上的 FOV 尺寸。这确立了 AION 和 Kinetix 的硬件组合作为大量不同显微镜应用的首选方法，利用更大的 FOV 或随之而来的高速成像提供的更高的吞吐量。

　　图2： 使用 100x 1.50 NA 物镜将 FN18 系统与 AION 和 Kinetix 提供的 FN25 进行比较。图像显示了固定的人成纤维细胞，细胞核 - DAPI(蓝色)，线粒体 - Tom20-Alexa488(绿色)，微管 - 微管蛋白 - Alexa555(红色)，肌动蛋白 - Alexa647(洋红色)。

　　AION 设计为在对角线为 25 mm(FN25)的 FOV 处完全衍射限制，适用于对应于 60x 1.4 NA 或更小的物镜孔径。这意味着物镜的 NA/Mag 值必须小于或等于 1.4/60，才能使用 FN25 FOV 提供衍射极限图像。因此，与更常见的FN18系统相比，使用高放大倍率和高NA物镜(例如100倍、1.45 NA)在启用FN25 FOV的系统上成像时，将使样品表面成像得两倍(图2)。AION还配备了可切换的针孔，为各种物镜(4x-100x)实现了理想共聚焦。

　　图 3： 使用 60x 1.42 NA 物镜将 FN18 系统与 AION 和 Kinetix 提供的 FN25 进行比较。图片显示黑腹果蝇卵母细胞、微管 – Alexa 555。

　　与前代产品相比，AION优化的光学器件和智能成像功能，结合Kinetix的速度和灵敏度，提高了共聚焦显微镜的质量和通量。AION 有三个不同的版本(α、λ 和 Σ)，硬件配置不同，都可以适应每个常见的显微镜输出。该设计甚至通过结合两个具有大视场的摄像机来同时对不同通道进行成像。当与两台 Kinetix 相机一起使用时，每个通道可以对 25 mm 对角线 FOV(450 x 450 μm2,40 倍物镜)的每秒 100 帧以上成像。使用动态反卷积可以实现 170 nm 的实时分辨率，从而在超过 500 μm 的深度生成高质量图像。针孔的电动化进一步提高了成像质量，其他电动化和自动化功能促进了用户友好性的提高。

　　AION提供的照明进一步支持了这种灵活性，该照明可以拥有多达两倍的激发线数量，甚至可以达到近红外(400-1100 nm)。高成像深度也是该系统的一大优势，可以通过使用更长的波长来减少更深样品中的像差或散射。尽管是共聚焦系统，但与传统系统相比，照明模式已得到改进，光毒性降低了数倍。此功能与活细胞应用高度相关，活细胞应用可以进行更长的持续时间，并且由于细胞在实验过程中承受的损伤减少，因此更加可靠。该设置的安装是用户友好的，因为它使用开源软件(如 Micro-Manager)实现所有元素。驱动程序可用于将硬件合并到其他控制软件中或创建自定义解决方案。

　　结论

　　新型 Line RE扫描 AION 系统与多达两台 Kinetix 相机相结合，达到了共聚焦技术的顶峰(图 1)。同时采集如此大的视场，结合高时空分辨率、实时反卷积和高成像深度，提供了一种具有前所未有的能力的成像工具。该系统具有很强的适应性，这要归功于其简单的硬件和软件对可用显微镜的实施以及紧凑的结构。AION-Kinetix 组合作为尖端的高质量共聚焦系统是无与伦比的。