土壤抗生素检测：方法、标准与含量测定实操指南​

土壤抗生素：为何检测很重要?

在现代农业和畜牧业中，抗生素被广泛用于促进生长和防治疾病。然而，随着这些物质的广泛使用，它们也可能通过各种途径进入土壤环境，引发一系列生态和健康问题。因此，土壤抗生素检测成为了守护生态健康的必要措施。

土壤抗生素检测，即通过科学的手段，对土壤中的抗生素种类和含量进行测定和分析。这一技术能够及时发现土壤中的抗生素污染问题，为环境治理和生态修复提供科学依据。抗生素在土壤中的残留可能对土壤微生物产生负面影响，破坏土壤生态系统的平衡。这些抗生素可能通过食物链进入人体，对人体健康造成潜在威胁。所以，及时准确地检测土壤抗生素含量，对于保护生态环境和人类健康具有重要意义。

常见土壤抗生素检测方法详解

(一)高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法(HPLC)是基于混合物中各组分在固定相和流动相之间分配系数不同的分离分析技术。在土壤抗生素检测中，以 NY/T 3787 - 2020 标准为例，对于四环素类、氟喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类和氯霉素类抗生素的检测，先将冻干土样(1.00±0.01g)用 10mL Na₂EDTA-Mellvaine 缓冲液(pH4.0)超声提取，再用有机混合提取剂(甲醇：乙腈：丙酮 = 4:4:2)补充提取，经过 4 次交替提取后，通过 HLB 固相萃取柱净化。在色谱分析时，采用 T3 色谱柱(150mm×4.6mm)，优化梯度洗脱程序，0 - 20min 乙腈比例从 10% 升至 80% ，31 - 35min 快速返回初始条件，流速稳定在 0.8mL/min，柱温保持 40℃ 。其优势在于分离效率高，可在短时间内实现复杂样品中抗生素的多组分分离，能有效分离土壤中结构相似的抗生素;分析速度快，适合批量样品检测，提高检测效率 。

(二)色谱 - 质谱联用法(HPLC - MS/MS 等)

色谱 - 质谱联用法，如 HPLC - MS/MS，是将液相色谱的高分离能力与质谱的高灵敏度和结构鉴定能力相结合。样品先通过液相色谱分离后，流出液进入离子源被离子化，产生的离子在加速电压作用下进入质谱质量分析器，按照离子的质荷比大小分离并列谱 。在复杂土壤基质中，其优势明显，高灵敏度使其能够检测到土壤中痕量的抗生素，检测限可达 ng/kg 级;高选择性则可通过质谱的特征离子信息，准确区分和量化不同结构的抗生素，避免基质干扰，即使土壤中存在多种结构相似的抗生素及复杂杂质，也能准确测定目标抗生素的含量。

土壤抗生素检测标准解读

(一)NY/T 3787 - 2020 标准剖析

NY/T 3787 - 2020《土壤中四环素类、氟喹诺酮类、磺胺类、大环内酯类和氯霉素类抗生素含量同步检测方法 高效液相色谱法》在土壤抗生素检测领域具有重要地位。该标准的适用范围明确，主要针对土壤样本中 5 大类共 11 种抗生素含量的检测 ，包括四环素类的土霉素、金霉素;氟喹诺酮类的环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星;磺胺类的磺胺噻唑、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶;大环内酯类的泰乐菌素;氯霉素类的氯霉素 。

在检测过程中，技术参数和操作要点至关重要。样品前处理需使用冻干土样(1.00±0.01g)，先经 10mL Na₂EDTA - Mellvaine 缓冲液(pH4.0)超声提取，再用有机混合提取剂(甲醇：乙腈：丙酮 = 4:4:2)补充提取，经过 4 次交替提取，能有效提高提取效率，使回收率达到 82 - 99% 。采用 HLB 固相萃取柱净化，使用前需用 5mL 甲醇和 10mL 水活化。色谱分析时，选用 T3 色谱柱(150mm×4.6mm)，优化后的梯度洗脱程序为 0 - 20min 乙腈比例从 10% 升至 80% ，31 - 35min 快速返回初始条件，流速稳定在 0.8mL/min，柱温保持 40℃ ，可实现高效分离。经多实验室验证，该标准方法的检出限为 0.1 - 1.0μg/kg(磺胺类最低) ，回收率在 74.1 - 99.2%(加标浓度 5 - 50mg/kg) ，精密度 RSD<10% ，确保了检测结果的准确性和可靠性。

(二)其他相关标准介绍

除了 NY/T 3787 - 2020 标准，在不同的应用场景和检测需求下，还有其他相关标准。在肥料中抗生素残留检测方面，GB/T 32951 - 2016《有机肥料中土霉素、四环素、金霉素与强力霉素的含量测定 高效液相色谱法》规定了有机肥料中这 4 种四环素类抗生素的检测方法 。该标准侧重于肥料产品，通过对肥料中抗生素含量的检测，可评估其在农业生产中对土壤可能造成的抗生素污染风险 。与 NY/T 3787 - 2020 相比，GB/T 32951 - 2016 的检测对象主要是有机肥料，检测的抗生素种类仅为 4 种四环素类，而 NY/T 3787 - 2020 针对土壤，检测的抗生素种类更广泛，涵盖 5 大类 11 种 。

在水质抗生素检测中，如 HJ 1398 - 2024《水质 18 种磺胺类抗生素和甲氧苄氨嘧啶的测定 高效液相色谱 - 三重四极杆质谱法》 ，虽然检测对象是水质，但其中的一些检测原理和前处理技术与土壤抗生素检测有相通之处 。该标准采用高效液相色谱 - 三重四极杆质谱法，能够准确测定水中多种磺胺类抗生素和甲氧苄氨嘧啶的含量 。在土壤抗生素检测中，当涉及到土壤中水溶性抗生素的研究时，可参考水质检测标准中的一些方法和思路 。这些不同的标准从不同角度和应用领域，为土壤抗生素检测提供了多样化的技术支撑和规范依据，科研人员可根据实际检测需求合理选择和参考。

土壤抗生素含量测定流程

(一)样品采集与保存

样品采集环节，需依据研究目的与要求确定采样点数量和深度。比如研究农田土壤抗生素污染，应在不同种植区域、不同施肥方式的地块设置采样点 。采样时，要使用干净、无污染的工具，像不锈钢铲子等，避免对样品造成二次污染。采集具有代表性的区域土壤，防止受到污染或人为干扰，可采用五点取样法、棋盘式取样法等，将多点采集的土壤混合成一个样品，以确保样品能反映整体土壤状况。

样品保存也至关重要，采集后的土壤样品应及时保存，以防其中的抗生素化合物分解或氧化。常用的保存方法是将样品置于洁净的棕色玻璃瓶中，在运输过程中避光冷藏，运回实验室后，在 0 - 4℃避光保存，并于一周内完成样品前处理 。若保存不当，如样品受潮或长时间暴露在高温、光照环境下，抗生素可能降解，导致检测结果偏低，无法准确反映土壤中抗生素的真实含量。

(二)样品前处理

样品前处理包括多个关键步骤。先将新鲜土壤置于不锈钢或聚四氯乙烯盘中，去除树枝、叶子和石子等异物，充分混匀。接着取适量混匀土样放入冷冻干燥机中脱水，冻干后的样品用球磨机或玛瑙研钵研磨充分，再过 60 目(孔径 0.25mm)标准土壤筛，为后续提取做准备。这一步骤能使土壤样品质地均匀，便于后续提取操作，且避免大颗粒杂质影响提取效果。

提取时，称取一定量预处理后的土样于聚丙烯离心管中，加入内标物使用液混匀，在 0 - 4℃避光保存一段时间，待甲醇挥发。然后加入乙二胺四乙酸四钠和乙腈 - Mcllvaine 缓冲液的混合液，涡旋震荡后置于超声波中，再进行离心，收集上清液，重复提取一次，合并两次提取液 。例如，在测定土壤中四环素类抗生素时，这种提取方法能有效将抗生素从土壤基质中分离出来，提高提取效率。

提取后的溶液往往含有大量杂质，需要进行净化处理。以 1000mL 纯水稀释提取液，并用硫酸调节 pH 值至合适范围 。将 SAX 阴离子交换柱与 HLB 固相萃取柱首尾串联，固定在固相萃取装置上，依次用甲醇和纯水活化萃取柱，保证柱头漫湿。提取液以一定流速通过小柱，待全部通过后，拆下 SAX 柱，用纯水淋洗 HLB 柱，去除小柱上的杂质，再用甲醇洗脱，收集全部洗脱液 。此净化过程可有效去除土壤有机质、矿物质等杂质，提高样品纯度，减少对后续仪器测定的干扰。

最后将洗脱液采用氮气在 40℃下缓慢吹至近干，用特定的混合液定容至一定体积，经尼龙滤膜过滤后，得到待测样品。定容和过滤步骤能使样品浓度适合仪器检测，同时去除可能存在的微小颗粒杂质，确保仪器进样的准确性和稳定性。

(三)仪器测定与数据分析

仪器测定常使用高效液相色谱 - 三重四极杆质谱仪等设备。在测定前，需设置合适的仪器参数。液相条件方面，柱温可设定为 40℃，流动相为乙腈和含一定比例甲酸的水溶液，流速控制在 0.3mL/min 左右，设置合适的梯度洗脱程序，如 0 - 1.5min 乙腈比例为 10% ，1.5 - 8min 乙腈比例从 10% 升至 70% ，8 - 8.1min 乙腈比例从 70% 快速降至 10% ，8.1 - 10min 保持 10% 乙腈比例 。质谱条件上，离子喷雾电压可设为 4.5kV，离子源温度 500℃ ，离子源气体 1 和气体 2 压力均为 50psi ，采用正离子检测模式 。通过这些优化的仪器参数，可实现对土壤中抗生素的有效分离和检测。

进样分析后，仪器会得到色谱图和质谱图。根据目标抗生素的保留时间和特征离子信息，与标准品图谱对比，确定样品中抗生素的种类。通过测定峰面积，利用外标法或内标法进行定量计算，得出土壤中抗生素的含量。例如，使用内标法时，根据内标物的峰面积与目标抗生素峰面积的比例关系，结合标准曲线，计算出目标抗生素的浓度。

数据分析过程中，要进行多次重复测定，计算相对标准偏差(RSD)，评估测定结果的精密度。一般要求 RSD 小于一定数值，如 10% ，以确保测定结果的可靠性。还可进行加标回收试验，在已知含量的土壤样品中加入一定量的标准物质，按照上述测定流程进行分析，计算回收率，回收率应在合理范围内，如 70% - 120% ，以验证整个测定方法的准确性。通过严谨的仪器测定和数据分析，能够得到准确可靠的土壤抗生素含量测定结果，为科研和环境监测提供有力的数据支持。

菲优特检测服务内容
·委托检测：环境检测、植物根/茎/叶/果实/籽粒检测、海水检测、土壤检测、海底沉积物检测、农林植物类检测、水产养殖检测、微生物检测、毒理测试等
·科研服务：分子生物学、代谢组学、蛋白质组学、基因组学、细胞服务、细菌服务、新药研发筛选模型构建、疾病动物模型构建及其他开放类服务项目