《食品科学》：西北农林科技大学王敏教授、韩林副教授等：沙棘原花青素的抗氧化和α-葡萄糖苷酶抑制活性

血糖控制是预防和治疗糖尿病的一个有效措施，α-葡萄糖苷酶在碳水化合物的水解中发挥着重要作用，通过抑制其活性可以有效控制餐后血糖水平，对糖尿病患者具有积极意义。

有研究表明氧化应激也被认为是引起糖尿病尤其是2型糖尿病的一个重要诱因。针对糖尿病的预防和治疗措施有很多，其中联合使用抗氧化剂和碳水化合物消化酶抑制剂是一种常见且有效的方法。

沙棘是一种胡颓子科沙棘属的落叶灌木或树。沙棘中存在的酚类化合物包括槲皮素、儿茶素、原花青素、酚酸等对健康益处良多，如抗氧化、清除自由基、抗炎和增强免疫等。目前对于沙棘原花青素（SBPC）的研究主要集中在提取纯化、免疫调节、细胞凋亡、抗氧化活性以及抗衰老作用等方面，尚缺乏针对SBPC抗氧化活性及其对α-葡萄糖苷酶抑制作用在糖尿病预防与改善方面的研究报道。

西北农林科技大学食品科学与工程学院的吴雪、韩林*、王敏*等首先测定了SBPC的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力以及Fe3+还原力，其次在细胞水平采用棕榈酸（PA）诱导HepG2细胞氧化应激并加以SBPC干预以评价其抗氧化能力。最后，通过测定酶抑制率、酶动力学以及进行分子模拟对接来阐述SBPC对

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SBPC体外抗氧化活性

由图1A可知，DPPH自由基的清除率随着SBPC和VC质量浓度升高而增大，且当SBPC质量浓度为10 μg/mL时，对DPPH自由基的清除率为98.18%，进一步计算SBPC的IC50为0.497 4 μg/mL，显著小于VC的4.806 μg/mL，说明SBPC具有较强的DPPH自由基清除能力。

由图1B可知，在质量浓度0～40 μg/mL范围内，ABTS阳离子自由基的清除率与SBPC、VC的质量浓度具有量效关系，当SBPC的质量浓度为40 μg/mL时，对ABTS阳离子自由基清除率为87.08%，进一步计算SBPC和VC的IC50分别为16.34 μg/mL和23.41 μg/mL，说明SBPC显示出比VC更强的ABTS阳离子自由基清除能力。

如图1C所示，在实验质量浓度范围内，Fe3+还原力随着SBPC的质量浓度升高而增大，同样地，SBPC的还原力显著高于VC。

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SBPC细胞水平上的抗氧化活性

2.1SBPC对HepG2细胞活性的影响

采用CCK-8试剂盒检测不同质量浓度的SBPC对HepG2细胞活性的影响，如图2A所示。在SBPC的质量浓度＞40 μg/mL条件下暴露24 h后，HepG2细胞活性显著降低，而≤30 μg/mL的SBPC对细胞活性没有影响，表明可采用≤30 μg/mL的SBPC对HepG2细胞进行干预。

PA刺激对HepG2细胞活力的影响结果如图2B所示。100 mmol/L的PA可造成细胞活力下降约50%。10 μg/mL的SBPC可使得细胞活力略微增加但没有显著性变化，20 μg/mL和30 μg/mL的SBPC干预使得细胞活力显著增加，逆转了细胞损伤。以上结果说明SBPC处理可以抑制PA诱导的细胞活力下降，但需要一定的工作浓度才能显著恢复细胞活力。

2.2SBPC对PA诱导的HepG2细胞ROS水平的影响

DCFH-DA是一种可以渗透细胞的一种荧光探针，进入细胞后，可以被细胞内的酯酶水解成DCFH（一种无荧光化合物），由于DCFH不能通透细胞膜，使得探针被装载到细胞内，细胞内的ROS将DCFH氧化生成2,7-二氯荧光素，发出绿色荧光。绿色荧光强度反映了细胞内ROS水平。如图3所示，与对照组相比，PA组绿色荧光强度显著增加（P＜0.05），说明PA刺激使得细胞内ROS大量产生，PA组ROS产生量约为正常组的4 倍。SBPC加入后，即使是低剂量的SBPC也能显著降低绿色荧光强度，并且呈现了一定的量效关系。

以上结果表明，PA刺激使得细胞ROS含量显著升高，引起细胞发生氧化应激，SBPC干预后，可以显著降低PA诱导的细胞ROS含量增加并存在一定的量效关系，从而改善细胞的氧化应激损伤。

2.3SBPC对PA诱导的HepG2细胞氧化产物及抗氧化酶活性的影响

进一步检测SBPC对细胞氧化产物及抗氧化酶活性的影响，结果如图4所示。PA刺激使得细胞脂质氧化产物MDA含量显著上升（图4A），说明细胞内脂质被氧化，30 μg/mL SBPC干预后MDA生成量与空白对照组相当，降低了约30%，显著抑制了脂质的氧化，表现了其抗氧化作用。

SBPC对HepG2细胞抗氧化酶活性的影响如图4B、C所示，PA显著抑制了SOD、GSH-Px的活性，SBPC干预后，显著恢复了SOD、GSH-Px的活性，说明SBPC能通过调控酶促抗氧化系统改善PA诱导的细胞氧化应激状况。

与GSH-Px相关的GSH和GSSG含量变化如图4D、E所示。PA处理降低了HepG2细胞中GSH的含量，相应的升高了GSSG的含量，从而使GSH/GSSG比值降低。与PA处理组相比较，SBPC干预显著升高GSH含量的同时降低了GSSG含量。特别地，当SBPC质量浓度为30 μg/mL时，能将HepG2细胞中的GSH和GSSG含量恢复至正常水平。

综上所述，PA刺激破坏了HepG2细胞内的氧化还原平衡，使得抗氧化酶活性降低，SBPC干预可显著上调抗氧化酶活性，从而抑制氧化产物的产生，有效改善HepG2细胞氧化损伤水平。

2.4 SBPC对PA诱导的HepG2细胞线粒体膜电位的影响

利用JC-1探针检测线粒体膜电位变化，JC-1分为聚合体和单体两种形式，正常健康细胞的线粒体的膜电位较高，JC-1以聚合体形式存在于线粒体中，呈现红色荧光；当线粒体膜电位降低时，JC-1转变为单体释放到细胞质中，呈现出绿色荧光。SBPC对线粒体膜电位的影响如图5所示。PA诱导HepG2细胞线粒体中JC-1聚合体含量显著减少，相应的升高了JC-1单体的含量，说明PA引起细胞线粒体膜电位显著降低。10 μg/mL的SBPC可使得细胞线粒体中JC-1聚合体的含量略微增加，但不具有显著差异，但20 μg/mL和30 μg/mL的SBPC干预后，显著增加了细胞线粒体中的JC-1聚合体含量，表现为红色荧光明显增强。以上结果表明SBPC可有效恢复PA诱导的线粒体膜电位水平，从而发挥线粒体保护作用，并呈剂量依赖性。

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SBPC对

以阿卡波糖为阳性对照，使用pNPG法测定了SBPC对α-葡萄糖苷酶活性抑制率，结果如图6所示，当SBPC质量浓度低于10 μg/mL时，随着质量浓度增加，其对α-葡萄糖苷酶的抑制效果呈现急剧增加趋势，SBPC质量浓度为10 μg/mL时，对α-葡萄糖苷酶的抑制率达65.29%，超过此质量浓度后，抑制率的增加有所减缓。总的来说，在实验质量浓度范围内，SBPC对α-葡萄糖苷酶的抑制作用随着质量浓度的增加而增加，呈现出剂量依赖性。进一步计算SBPC和阿卡波糖的IC50分别为8.646、10.980 μg/mL，SBPC显示出了较阿卡波糖更高的抑制活性，说明在体外的研究中SBPC对α-葡萄糖苷酶具有较强的抑制能力。

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SBPC对

在不同SBPC质量浓度的条件下进行α-葡萄糖苷酶抑制可逆性的探究，以酶浓度对酶促反应速率作图，结果如图7所示。酶浓度对酶促反应速率的拟合图中，随着SBPC质量浓度的增加，直线斜率降低，并且所有直线都经过原点，说明SBPC的抑制α-葡萄糖苷酶的过程可逆。

为了进一步阐明SBPC对α-葡萄糖苷酶的抑制机制，确定SBPC对α-葡萄糖苷酶的抑制类型，在不同底物和SBPC质量浓度下测定SBPC的抑制动力学，绘制Lineweaver-Burk双倒数图，1/[pNPG]与1/V之间的线性关系如图8A所示（[pNPG]表示底物浓度，V表示反应速率），通过Lineweaver-Burk双倒数曲线可以看出米氏常数Km和最大酶解速率Vmax的变化。随着SBPC质量浓度的增加，Vmax不变，Km增加，具有竞争性抑制作用的特点，并且双倒数曲线图交于Y轴，表明SBPC对α-葡萄糖苷酶表现出竞争性抑制作用，即SBPC和淀粉底物共同竞争α-葡萄糖苷酶的结合位点，形成酶-抑制剂复合物，从而抑制α-葡萄糖苷酶的活性。图8B描述了双倒数曲线的斜率与不同质量浓度SBPC之间的关系，很明显，二者呈现出良好的线性关系，该结果表明了在α-葡萄糖苷酶上有一个或一类抑制SBPC结合的位点。

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分子模拟对接

SBPC经鉴定主要由表儿茶素没食子酸酯、原花青素B、没食子儿茶素、没食子儿茶素/没食子儿茶素二聚体4 种组分，其结构式如图9所示。为了阐明SBPC如何与α-葡萄糖苷酶结合，开展分子对接分析。参考已报道的研究，酿酒酵母来源的异麦芽糖酶的晶体结构（PDB ID：3A4A）与α-葡萄糖苷酶有高度的同源性和相似性，常用在分子模拟对接中以分析小分子化合物与α-葡萄糖苷酶的相互作用力和活性口袋，对接结果如图10所示。

SBPC的组成物均可以深入到α-葡萄糖苷酶活性口袋，作为潜在的配体占据了α-葡萄糖苷酶与其底物结合进行催化作用的位置，进而影响了其酶的活性。抑制剂与酶的相互作用中存在5 种作用力：强氢键、弱氢键、疏水相互作用、离子相互作用和阳离子-Pi相互作用，它们是酶活性位点和抑制剂发生作用的非共价力。分子对接结果具体信息如表1所示，4 种配体的酚羟基与α-葡萄糖苷酶的不同氨基酸残基之间形成了不同数量的强氢键，表儿茶素没食子酸酯、原花青素B、没食子儿茶素、没食子儿茶素/没食子儿茶素二聚体分别与α-葡萄糖苷酶的氨基酸残基有9、4、6 个和4 个强氢键，这在一定程度上影响了其结合能。此外，4 种配体与α-葡萄糖苷酶的不同氨基酸残基之间还形成了较强的疏水结合作用，这也是SBPC与酶结合的重要驱动力。这些相互作用会改变酶的构象，从而抑制其活性。另外，根据对接结果计算模拟结合能Eb，4 种配体Eb均小于0，也就是说它们之间的相互作用是自发进行的。此外，Eb值越小，表明配体更容易进入α-葡萄糖苷酶活性口袋竞争活性位点。总的来说，SBPC与α-葡萄糖苷酶的结合主要是由氢键和疏水作用力和驱动的，其作用机理可能是由于活性物质插入α-葡萄糖苷酶的催化中心，避免了底物的进入，从而抑制了α-葡萄糖苷酶的活性。

PA是人体主要的游离脂肪酸之一，在正常的生理代谢过程中由脂肪代谢产生，随之转化为甘油三酯储能以供机体生命活动。过量的PA已经被证明可以引起胰岛细胞、肝细胞以及肠细胞在内的多种细胞的氧化应激，从而产生不利影响。研究发现100 mmol/L的PA诱导显著地降低了HepG2细胞的存活率。值得注意的是，PA作为脂毒性物质可通过氧化应激和炎症诱导细胞功能障碍甚至死亡，是引起糖尿病的一个重要诱因。ROS是细胞正常代谢的产物，一般而言，细胞内ROS数量保持着动态平衡以维持细胞稳态。当受到外界刺激时，细胞中ROS大量产生，引发氧化应激从而造成细胞损伤。采用DCFH-DA荧光探针探究了细胞内ROS含量变化，并进一步探究了其对线粒体膜电位的影响，结果显示，PA刺激细胞内ROS水平显著升高的同时显著降低了线粒体膜电位水平，造成了细胞氧化应激损伤，这与伊丽则热·艾拜杜拉的研究一致。通过实验测定了细胞中氧化产物以及抗氧化酶活性，结果表明PA诱导显著升高了脂质氧化产物MDA含量的同时还显著降低了SOD、GSH-Px的活性，且PA处理降低了HepG2细胞中GSH的含量，相应升高了GSSG的含量，从而使GSH/GSSG比值降低，破坏了细胞内的氧化还原平衡。崔源等的研究也证实了这一结论。

随着沙棘产业的壮大，针对其营养物质及功能成分的研究也是一大热点。沙棘果实中丰富的SBPC作为具有独特的生物活性的天然产物广泛引起了人们的关注。本研究在体外对SBPC的抗氧化性进行鉴定，结果表明，SBPC与DPPH自由基、ABTS阳离子自由基的清除率以及Fe3+还原力存在着明显的量效关系，并且在实验浓度范围内的自由基清除作用均强于VC，SBPC表现出强大的抗氧化能力。进一步在细胞水平上进行验证，实验结果表明，SBPC不仅显著上调抗氧化酶活性、抑制氧化产物的产生，还能显著减少细胞ROS的产生（P＜0.001），并恢复细胞线粒体膜电位水平从而改善HepG2细胞氧化损伤或保护其不被氧化损伤。同样地，Lin Ximeng和Liu Keshan等的研究也证实了不同质量浓度的SBPC可显著降低ROS水平来改善氧化损伤并减轻氧化应激引起的线粒体损伤和功能障碍。

为了克服α-葡萄糖苷酶抑制剂的副作用，从天然产物中获取活性优异、副作用少的α-葡萄糖苷酶抑制剂是解决这一问题的有效途径并广泛引起了人们的关注。多酚类物质是公认的良好的抗氧化剂并且已有研究证实了其的α-葡萄糖苷酶的抑制作用。检测SBPC对α-葡萄糖苷酶的抑制作用结果表明，SBPC是有效的葡萄糖苷酶抑制剂，其IC50为8.646 μg/mL且该抑制过程可逆。SBPC对葡萄糖苷酶的抑制模式为竞争性抑制且双倒数曲线的结果表明在α-葡萄糖苷酶上有一个或一类抑制SBPC结合的位点。此外，分子对接分析结果显示了SBPC的4 种组成单体-葡萄糖苷酶的准确结合位置，SBPC与α-葡萄糖苷酶的结合主要是由氢键和疏水作用力和驱动的，其作用机理可能是由于活性物质插入α-葡萄糖苷酶的催化中心，避免了底物的进入和构象的改变。

更有趣的是，本研究发现SBPC抑制α-葡萄糖苷酶活性的剂量与其抑制PA诱导HepG2细胞引起的氧化应激的剂量相当，也就明确其在一个剂量下可有效地发挥作为抗氧化剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂的双重作用，显示出其在防治糖尿病中的巨大应用潜力，为SBPC用于糖尿病功能性食品的开发提供理论支持。

本文《沙棘原花青素的抗氧化和

实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网