《食品科学》：浙江大学林星宇研究员等：基于水凝胶芯片的数字PCR精准定量葡萄汁中的大肠杆菌O157

食源性疾病是全球公共卫生领域的重大挑战，其中，大肠杆菌O157作为重要的食源性致病菌，人类健康构成重大威胁。研究表明，大肠杆菌O157是果汁污染中最常见的病原微生物之一，尤其在葡萄汁中具有特殊的适应能力。

水凝胶材料因其独特的三维网络结构和优异的生物相容性，近年来在生物检测领域展现出巨大潜力。水凝胶基质能够降低样品基质干扰，简化前处理步骤，通过空间限域效应将核酸扩增反应局域化，成为原位核酸扩增检测的理想载体。常规化学裂解因为引入外源性试剂影响后续扩增效率且无法进行原位检测，而热裂解技术结合水凝胶能够实现微生物的原位裂解。作为一种简便、高效的细胞裂解方法，无需额外试剂和复杂操作，且对易受热影响的细胞（如大肠杆菌）具有良好的可行性。

浙江大学生物系统工程与食品科学学院易子涵、林星宇*开发一种基于水凝胶芯片的直接数字PCR技术，实现对果汁中大肠杆菌O157的特异性数字PCR检测。该方法通过将样品与水凝胶数字PCR体系直接混合，室温条件下交联形成水凝胶芯片，无需复杂的样品前处理，利用热裂解技术释放细菌的DNA，结合数字PCR体系进行特异性扩增，扩增过程中，每个DNA分子原位扩增形成一个荧光点，通过简单的终点荧光计数即可实现单细菌水平的精确定量。该技术不仅具有良好的抗基质干扰能力，还简化样品处理流程，缩短检测时间，为食源性致病菌的快速检测提供新的技术路径和方法。

1 水凝胶材料表征

水凝胶形成的三维网状结构能够延缓DNA分子的扩散，在扩增结束时达到数字化检测的效果中起到了至关重要的作用。通过冷冻、干燥和切分等样品操作，对PEG水凝胶进行红外表征。红外光谱图显示了PEG水凝胶的主要官能团峰位（图1A）。观察到在不同波数区域的吸收峰：约在2 880 cm―1处的吸收峰对应于C—H的伸缩振动，这是PEG主链中甲烷基（—CH2—）的特征峰。约在1 450 cm―1和1 350 cm―1处的峰分别为—CH2—弯曲振动和—CH3弯曲振动的特征峰，进一步验证了PEG水凝胶的化学组成。此外，1 100 cm―1处的吸收峰为C—O—C对称伸缩振动，这是PEG链上醚键的特征峰。该峰显示出聚合物骨架的稳定性。此外，约在950 cm－1处的吸收峰可归因于C—H弯曲振动，主要来自4 arm-PEG-ACRL的PEG链。840 cm―1处的吸收峰与C—S伸缩振动相关，可能来自SH-PEG-SH中的巯基结构，进一步确认了巯基的引入。通过红外光谱确认了迈克尔加成反应的成功以及水凝胶内聚合物网络的稳定性。这些特征峰揭示了PEG水凝胶的官能团分布，为进一步的性能研究提供了基础。

通过扫描电子显微镜进行表征，PEG水凝胶的微观结构得到了详细的呈现（图1B）。图像显示水凝胶具有明显的三维多孔结构，其孔道相互连接，形成复杂的网络。从图像中可以观察到，水凝胶的孔径分布较为均匀，孔径在纳米级别。这种均匀的孔径有利于水分子和其他小分子的穿透和扩散，从而赋予水凝胶优良的吸水性和生物相容性。

通过差示扫描量热仪进行表征，可以评估PEG水凝胶的热稳定性与热学性能，为其在数字PCR核酸检测中的应用提供依据。在PCR实验中，温度通常会从室温升高至95 ℃，随后降至60 ℃进行循环。差示扫描量热分析图像表明，在室温至95 ℃的温度范围内，PEG水凝胶的热流量变化较小，没有明显的相变或热分解现象，表现出相对稳定的热学特性（图1C）。因此，PEG水凝胶在数字PCR核酸检测中的应用效果理想，能够在高效、稳定的条件下进行反应，保证实验的可靠性与精准性。

2 水凝胶数字PCR的抗抑制特性和可行性验证

以水凝胶为反应基质，建立一种无需DNA提取和纯化的直接数字PCR检测方法，实现对大肠杆菌O157的高灵敏、快速检测。水凝胶具有独特的三维网络结构，可将细菌样本与PCR体系均匀分布在微孔结构中，从而实现单细菌水平的空间分离和原位扩增。检测原理如下：细菌样本中的大肠杆菌O157通过热裂解释放DNA模板，并与水凝胶基质中的PCR体系结合。每个细菌释放的DNA在PCR扩增过程中会原位形成独立的扩增产物，产生单一的荧光信号点。当目标细菌浓度不同，水凝胶内形成的荧光点数目也随之变化。最终，通过观察荧光点，并对终点荧光图像进行计数，从而实现对大肠杆菌O157的数字化定量分析。为了验证水凝胶数字PCR在不同样本体系中的抗抑制性能，分别使用目标菌引物对阴性（Juice-Negative）和阳性（Juice-Positive）葡萄汁体系、阴性（H2O-Negative）和阳性（H2O-Positive）水体系进行实时PCR检测，结果如图2A所示。阳性水体系显示明显的荧光信号增长曲线，而阴性水体系、阴性葡萄汁体系以及阳性葡萄汁体系均未显示显著的荧光信号。这表明葡萄汁样本中存在抑制PCR扩增的物质，影响了传统PCR的检测效果。

随后，对葡萄汁样本使用水凝胶数字PCR进行扩增，结果如图2B所示。在阳性葡萄汁样本（PEGPositive）中，成功观察到清晰、明亮的荧光点，而阴性葡萄汁样本（PEG-Negative）中未观察到荧光点，说明水凝胶体系具有良好的抗抑制效果，能够实现对样品无需前处理的直接PCR扩增。

回收水凝胶中荧光点区域和背景区域的扩增产物后，进行琼脂糖凝胶电泳分析（图2C）。电泳结果显示，在荧光点区域对应的扩增产物条带大小约为600 bp，与预期目标片段大小一致；而背景区域未检测到扩增条带，进一步验证了荧光点由扩增产物形成，且扩增结果准确。综上所述，水凝胶数字PCR体系在葡萄汁样本中具有抗抑制效果，明显优于传统水体系。该体系无需复杂的DNA提取和纯化步骤，即可直接对样本中的目标细菌进行检测，极大地简化了操作流程，缩短了检测时间，具有快速、准确的优势，因此适用于现场快速检测食品样品中的大肠杆菌O157。

3 引物浓度对水凝胶数字PCR的影响

为了获得信噪比高、荧光点大小合适的数字化检测方法，分别测试了荧光点在不同引物浓度、不同SYBR Green染料添加量，以及不同循环反应阶段时间（变性、退火延伸）下的表现。在此基础上选取了最优的反应体系。实验选择10、50、100、200、300 nmol/L的引物浓度进行优化（图3A），调整引物浓度不影响扩增荧光点个数（图3B），当引物浓度在10～100 nmol/L时扩增荧光点的信噪比较低，引物浓度增加到200、300 nmol/L时，信噪比提高（图3C）。选择200 nmol/L为最优引物浓度。

4 SYBR Green染料添加量对水凝胶数字PCR的影响

实验选择1、2、4、6、10×的SYBR Green染料添加量进行优化（图4A），调整SYBR Green的添加量不影响扩增荧光点个数（图4B），说明水凝胶对SYBR Green有很好的耐受能力。当SYBR Green的添加量在1×时扩增荧光点的信噪比较低，提高到2×时信噪比提高，再提高SYBR Green的添加量，使得背景亮度提升，信噪比降低（图4C）。选择2×为最优SYBR Green添加量。

5 变性时间对水凝胶数字PCR的影响

实验选择10、20、30 s的变性时间进行优化（图5A），减少变性时间对扩增荧光点的数量（图5B）和荧光点信噪比（图5C）都没有显著影响。选择10 s为最优变性时间。

6 退火延伸时间对水凝胶数字PCR的影响

实验选择60、30、10 s的退火延伸时间进行优化（图6A），随着退火延伸时间的降低，荧光点数量保持不变（图6B）。降低至10 s时扩增信噪比降低（图6C）。所以选择30 s为最优退火延伸时间。

7 细菌直接检测效果评价

为了进一步验证水凝胶数字PCR方法对大肠杆菌O157直接检测的能力，对不同检测方法进行细菌定量比较分析。具体包括以下3 种方法：1）直接水凝胶数字PCR方法：细菌无需进行DNA提取和前处理，直接与水凝胶数字PCR反应体系混合后进行扩增，随后对终点荧光图像进行计数得出细菌浓度；2）细菌染色计数法：通过染料对样本中的细菌进行染色处理，随后在显微镜下直接观察和计数；3）传统平板计数法：将样本进行稀释后涂布于培养基平板上，经过培养计数得出细菌浓度。

图7表明，水凝胶数字PCR具有明显的优势，细菌染色法缺乏特异性，可能导致假阳性或假阴性结果，而平板培养法则由于检测时间较长，限制了其在快速检测中的应用。通过对大肠杆菌O157菌液进行检测，比较了直接水凝胶数字PCR、细菌染色计数法和传统平板计数法的检测结果。数据分析显示，3 种方法检测得到的细菌浓度无显著性差异，进一步验证了本研究所开发的水凝胶数字PCR方法在细菌直接检测中的高可行性和准确性。

8 特异性验证

在包含5 种不同菌株（即大肠杆菌O157、普通大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌）及混合菌（大肠杆菌O157、普通大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单核增生李斯特菌）的反应体系中加入针对大肠杆菌O157的特异性引物，利用本方法进行检测。图8表明，只有大肠杆菌O157组和包含大肠杆菌O157的混合菌组的样本成功扩增，产生了明亮、清晰的荧光点信号，其他4 种非目标菌都没有产生有效地扩增信号。这一结果验证了本方法的高特异性，可准确识别并检测目标菌株，避免了非目标菌株的干扰。

9 检测标准曲线的建立及灵敏度测试

水凝胶数字PCR扩增结果显示，阴性对照未观察到荧光点，阳性样本在不同梯度浓度下均表现出有效扩增，且细菌数量与荧光点数量之间呈正比例关系（图9A）。通过以菌液浓度对数为横坐标（X）和对应的检测浓度对数（Y）为纵坐标建立标准曲线，发现大肠杆菌O157的检测浓度与菌液浓度之间呈现良好的线性关系，检出限为4.0×101 CFU/mL，拟合曲线为Y＝1.041X－0.153 8，决定系数R2为0.994 3（图9B）。优化的水凝胶PCR扩增体系表明，设计的引物大小和荧光点的大小均匀、形状一致，确保了检测的有效性，并具有统计学意义。这些结果表明，所建立的水凝胶PCR体系具有良好的灵敏度，能够有效应用于食品样本的直接快速检测中。

10 人工污染葡萄汁样本分析

选取人工稀释大肠杆菌O157染菌的葡萄汁样本，并使用5 个不同稀释倍数的菌液浓度进行实验。根据GB 4789.36—2016检测方法，通过比较稀释涂布平板法与水凝胶数字PCR扩增方法结果，以验证检测葡萄汁样本的可行性，结果见表2。结果表明，本方法可在40 min内完成从样品处理到结果报告的特异性检测全过程，显著缩短了检测时间，5 个加标葡萄汁样本均可检出，回收率为96.9%～112.0%，相对标准偏差为3.6%～12.4%。

结论

本研究建立了一种基于水凝胶数字PCR的大肠杆菌O157快速检测新方法。鉴于大肠杆菌O157作为重要的食源性致病菌，能够引发严重的食物中毒和溶血性尿毒综合征，建立快速、灵敏的检测方法具有重要意义。

通过对水凝胶材料进行红外光谱、扫描电子显微镜和差示扫描量热表征，并优化PCR扩增条件（包括扩增程序、引物浓度和荧光染料用量），成功开发了一种高效的检测体系。该方法不仅具有较高的检测灵敏度和特异性，还具备操作简便、快速高效等优势，具体体现在以下几个方面：1）开发了基于水凝胶芯片的数字PCR技术，实现了对大肠杆菌O157的精准直接细菌检测；2）该方法对目标菌株具有高度的特异性，检出限可达单细菌水平，并且在测试过程中与其他常见食源性致病菌（如普通大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、单核增生李斯特菌等）没有交叉反应。通过特异性引物扩增目标基因，能够有效避免假阳性和假阴性结果的出现；3）该方法无需复杂的样品前处理，具有良好的抗抑制效果，显著简化了实验流程。在与传统的细菌染色计数法和平板计数法进行对比时，该方法与这些常规方法所得结果无显著性差异，但所需时间更短，且特异性更高；4）在人工污染葡萄汁样品的验证实验中，阳性检出率为100%，且回收率为96.9%～112.0%，相对标准偏差为3.6%～12.4%。从取样到结果报告，整个检测过程仅需40 min即可完成，相较于传统方法，检测时间显著缩短。本研究所开发的基于水凝胶芯片的数字PCR技术不仅适用于葡萄汁等食品安全领域的快速检测，还可以拓展应用于环境监测、临床诊断等多个领域。该方法为食品安全的快速检测提供了新的技术手段，具有重要的实际应用价值和广阔的市场前景。

本文《基于水凝胶芯片的数字PCR精准定量葡萄汁中的大肠杆菌O157》来源于《食品科学》2025年46卷第15期1-9页，作者：易子涵，林星宇。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250103-015。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：王雨婷 ；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。