AbMole丨Hygromycin B如何助力构建稳转细胞株与转基因动物模型

Hygromycin B（潮霉素B）是一种由吸水链霉菌（Streptomyces hygroscopicus）产生的氨基糖苷类抗生素，具有广谱的蛋白合成抑制活性，广泛应用于分子生物学和细胞工程领域。其作用机制主要通过干扰核糖体的易位过程，从而抑制原核及真核生物中的蛋白翻译。由于其可被抗性基因（如hph）编码的磷酸转移酶失活，Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素B，AbMole，M2761）已成为基因工程研究中重要的筛选工具，尤其在构建稳定转染细胞株、转基因动物模型及植物遗传转化等研究中具有重要应用。

一、Hygromycin B（潮霉素B）的作用机理

Hygromycin B（潮霉素B，AbMole，M2761）可通过结合核糖体A位点，增强tRNA与核糖体的结合，从而阻断肽链延伸过程中的易位，抑制蛋白质合成。此外，Hygromycin B还可诱导mRNA的错读，进一步干扰翻译过程。Hygromycin B在细菌、酵母、植物细胞和哺乳动物细胞中均表现出抑制活性[1, 2]。

二、Hygromycin B（潮霉素B）的科研应用

1.Hygromycin B（潮霉素B）在原核细胞抗性筛选中的应用

Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素B，AbMole，M2761）可用于原核系统的筛选。hph和aphIV是常用的Hygromycin B的抗性基因。hph基因，即潮霉素B磷酸转移酶基因，可以对Hygromycin B进行磷酸化修饰，使其失去核糖体结合能力。实验人员可以利用DNA重组技术将外源基因整合到含有hph或aphIV的质粒载体上，当该质粒被转化进入细菌（如大肠杆菌）后，通过在生长培养基中加入适当浓度的Hygromycin B，可以有效地抑制不含有该质粒的菌落生长。这使得研究人员能够高效地筛选出成功转化了目标质粒的菌株，用于后续实验。

图1.带有潮霉素B磷酸转移酶基因的载体

2.Hygromycin B（潮霉素B）在构建稳定转染细胞株中的应用

Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素B，AbMole，M2761）是筛选稳定转染细胞株的强有力工具。将潮霉素抗性基因（hph）与目的基因共同构建于同一质粒载体上，并将其导入哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞中。之后使用含Hygromycin B（潮霉素B，AbMole，M2761）的培养液进行长期筛选。未成功整合外源基因及抗性基因的细胞因缺乏保护机制，其蛋白质合成被抑制而死亡；而成功整合了抗性基因的细胞则能够存活并增殖，最终形成稳定的细胞系。潮霉素B已成为研究细胞功能、基因过表达、RNA干扰等实验的常用抗生素。此外，在一些复杂的实验设计中，研究人员常利用多种抗性基因进行多重筛选。例如，将潮霉素与G418联合使用，可以筛选同时表达两个独立外源基因的细胞株，这对于研究蛋白相互作用或协同效应至关重要[3]。

3.Hygromycin B（Hygrovetine）在转基因动物与植物模型开发中的应用

在模式生物的开发中，Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素B，AbMole，M2761）同样扮演了关键角色。在构建转基因小鼠、线虫（如C. elegans）或其他模式生物时，hph基因可作为有效的遗传筛选标记。通过显微注射或其他方法将构建好的转基因元件导入受精卵细胞后，在后续的培养或筛选中加入Hygromycin B，可以方便快捷地鉴定出成功整合了外源基因的细胞，大大提高了构建转基因动物模型的效率。在植物生物学领域，Hygromycin B被广泛用于筛选转化后的植物细胞和组织。农杆菌介导的转化或基因枪法转化后，植物组织在含Hygromycin B的培养基上生长，只有成功表达了hph基因的细胞才能发育成完整的抗性幼苗，从而获得转基因植株。这对于作物基因功能研究和育种工作具有重要意义。

三、范例详解

J Med Chem. 2023 Dec;17138–17154.

兰州大学、徐州医科大学的研究团队在上述文章中以先前发现的神经肽FF受体多功能激动剂DN-9为基础，设计并合成了7种订书肽（Stapled Peptides）类似物，并通过多维度实验评估它们的活性，最终筛选出最优候选活性分子。实验人员以DN-9为母肽，通过引入α-烯基氨基酸并进行关环复分解（RCM）反应合成7种全烃订书肽。在体外实验中，科研人员通过钙动员实验评估订书肽对MOPr、κ-阿片受体（KOPr）、δ-阿片受体（DOPr）及NPFF₁R、NPFF₂R的激动活性；在小鼠血浆和脑匀浆中测定代谢稳定性，计算降解半衰期。在体内实验中，科研人员采用甩尾实验评估皮下（s.c）、脑室内（i.c.v.）和口服（p.o）给药后的镇痛活性及持续时间；通过药理学实验（如使用受体拮抗剂）明确镇痛作用机制；借助旋转杆实验、胃肠道转运（GIT）实验、条件性位置偏爱（CPP）实验、纳洛酮诱发戒断实验及全身体积描记法，评估运动损伤、便秘、成瘾性和呼吸抑制等副作用；通过药代动力学研究（LC-MS/MS）分析最优化合物的血脑屏障穿透能力。研究人员在进行体外钙动员实验时，为了筛选稳定表达阿片受体及神经肽FF受体的CHO细胞，使用了由AbMole提供的Hygromycin B（Hygrovetine，潮霉素B，AbMole，M2761），筛选浓度为100μg/mL[4]。

图2. 7种订书肽的体内实验结果[4]

参考文献及鸣谢

[1] Linda Gritz, Julian %J Gene Davies, Plasmid-encoded hygromycin B resistance: the sequence of hygromycin B phosphotransferase gene and its expression in Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae, 25(2-3) (1983) 179-188.

[2] M Dutt, JW %J Plant cell reports Grosser, An embryogenic suspension cell culture system for Agrobacterium-mediated transformation of citrus, 29(11) (2010) 1251-1260.

[3] Robert F Santerre, Jenna D Walls, Brian W Grinnell, Use of vectors to confer resistance to antibiotics G418 and hygromycin in stably transfected cell lines, Gene Transfer and Expression Protocols, Springer1991, pp. 245-256.

[4] M. Zhang, B. Xu, N. Li, et al., All-Hydrocarbon Stapled Peptide Multifunctional Agonists at Opioid and Neuropeptide FF Receptors: Highly Potent, Long-Lasting Brain Permeant Analgesics with Diminished Side Effects, J Med Chem 66(24) (2023) 17138-17154.