Sci Adv丨建立多分辨率的人胚胎全脑图谱和人胚胎中脑图谱

人类中脑多巴胺能神经元体外分化在帕金森病病理模型构建与临床细胞治疗中均起到重要作用。然而不同体外分化体系在转录水平上与体内组织的相似性缺乏可靠的衡量标准。

近日，新加 坡国立大学杜克国大医学院 (Duke-NUS Medical School)Alfred Sun课题组与John Ouyang课题组在Science Advances期刊发表了题为BrainSTEM: A single-cell multi-resolutionfetalbrain atlas reveals transcriptomic fidelity of human midbrain cultures的论文。该研究建立了多分辨率的人胚胎全脑图谱和人胚胎中脑图谱，用于更精准地表征体外中脑培养体系的转录组特征和区域纯度，并提出了双层投射框架 BrainSTEM：先将数据映射至全脑图谱以识别脑区来源，再将预测为中脑的细胞投射到高分辨率的中脑亚图谱，从而揭示包括稀有亚群在内的多样细胞类型。

首先，作者构建了两个单细胞人脑图谱，即人胚胎全脑图谱和人胚胎中脑图谱。作者对 Braun et al. (Science, 2023) 与 Zeng et al. (Cell Stem Cell, 2023) 报道的单细胞人脑数据集随机下采样，并利用 RPCA 方法进行数据集整合，构建了包含 39 位捐献者、67 万余个细胞，时间跨度从受精后 3 周到 14 周的人胚胎全脑图谱。经过统一细胞类型注释和标志基因鉴别，作者共鉴定出 23 种细胞类型，包括神经元、神经祖细胞和非神经细胞。其中神经元进一步分为 10 种亚型，既有传统以神经递质划分的多巴胺能 (DA)、 胆碱能、GABA能、谷氨酸能和 5-羟色胺能神经元，也有基于标志基因标注的亚型。

为了探索细胞的脑区特异性，作者基于区域标注训练了 kNN 分类器，发现多种神经元和神经祖细胞在前脑、中脑和后脑表现出独特的转录特征。例如，中脑 DA 神经元和前脑谷氨酸能神经元具有极高的区域特异性，而前脑 5-羟色胺能神经元则缺乏明显的特征信号。放射状胶质细胞在前脑特异表达 EMX2、FOXG1，中脑对应 EN1，后脑则由 HOX 基因家族标记。研究发现了新的 DA 神经元区域特异性标志基因，如 ELOVL3、MYRIP 与中脑 DA 神经元的身份密切相关。整体上，不同神经元的区域特征基因重叠较少，显示各脑区发育具有高度专一性。

进一步，作者从全脑图谱中提取出中脑相关数据，并与 Birtele et al. (Development, 2022) 报道的中脑数据集相结合，构建了迄今规模最大的人胚胎中脑的单细胞图谱。该数据集整合了 Braun et al.、Zeng et al. 以及 Birtele et al. 的最新数据，共计 10 万余个细胞，时间跨度为受精后 3 周到 14 周。在该图谱中，他们识别出多种中脑细胞类型，包括多个神经元类型与其对应的神经祖细胞亚群，如谷氨酸能、背/腹侧 GABA 能、红核 (hRN)、多巴胺能神经元 (hDA) 以及视丘下核 DA 神经元 (hDA.STN) 等。针对中脑腹侧相关细胞进行的拟时间序列分析揭示了这些细胞类型间的谱系关系：hRN、hDA 和 hDA.STN 可能源自共同的中间祖细胞 hNProg.DARN，值得注意的是，这也是首次在中脑图谱中检出 hDA.STN 细胞群；而LMX1A、RGS4 等标志基因在该谱系中呈现出的动态变化，也提示 hDA.STN与 hDA 神经元具有发育上的密切联系。

基于上述的两个单细胞人脑图谱，作者提出了 BrainSTEM 双层投射框架：第一层投射是将体外分化的单细胞数据投射到人胚胎全脑图谱，以判断这些细胞属于哪个脑区和哪一类细胞；第二层投射则是在第一层结果中筛选出预测为中脑身份的细胞，再将它们投射到人胚胎中脑图谱，从而获得高分辨率与保真度的亚群分类。这样的两步设计避免了单纯依赖中脑参考导致的“过度预测”，也能有效检测出培养体系中混杂的非中脑细胞，从而更真实地反映培养体系的区域纯度。与传统的一步映射（Direct Mapping）相比，BrainSTEM 在识别细胞区域来源上更准确，也更能揭示体外体系中的“杂质”细胞成分。

利用 BrainSTEM 框架，作者系统性地评估了体外分化的中脑单细胞数据。本研究纳入的查询数据集包括了一个来源于 Alfred Sun 课题组的数据集，以及经详尽检索可获取的已公开发表的体外分化中脑单细胞数据，共计 13 个数据集，超过 140 万个细胞，涵盖 2D 与 3D 培养体系以及帕金森病相关模型。分析发现，几乎所有体系都存在不同程度的非中脑细胞“污染”，某些数据集中预测为前脑或后脑来源的神经元比例甚至超过一半。这说明虽然这些分化体系能够生成目标的 DA 神经元，但区域纯度仍在较低水平。比较发现，大部分体系在分化第 30–40 天出现中脑身份细胞比例的高峰。3D类器官方案在中脑纯度上并不一定优于 2D 培养，而一些 2D 体系在晚期也能产生较高比例的中脑身份细胞，但这些细胞大多仍停留在祖细胞阶段而非成熟神经元。

在第一层投射中预测为中脑细胞的数目超过 1000 的 7 个数据集进入了第二层投射。结果显示，不同体外分化体系在生成 hDA 及其祖细胞之余，也生成了不同数量的腹侧 GABA 能神经元与其祖细胞、谷氨酸能神经元与其祖细胞。BrainSTEM 报道的腹侧细胞指数也侧面印证了细胞分类预测结果。作者还发现，在不同中脑分化体系中，诸如生长因子 FGF8 的使用和 CHIR 浓度的差异，会显著影响 hDA 的产量。在一鱼藤酮诱导帕金森病模型中，第二层投射得到的 hDA 细胞群相对于对照组显示了小胶质细胞相关基因富集，说明 BrainSTEM 可用于支持帕金森病病理机制相关研究。

通过 BrainSTEM 双层投射框架，作者不仅验证了当前中脑分化体系在纯度和成熟度上的不足，也提供了一个量化和比较不同体系的通用标准。BrainSTEM 的 R 包和数据库已经上线。未来研究者可以利用该工具便捷地评估自己的培养体系，判断生成的DA 神经元是否真正具备中脑区域身份，及时发现并减少非目标区域的细胞“污染”。这对于优化帕金森病模型、改进干细胞治疗中的神经分化策略，都具有重要价值。

新加坡国立大学杜克国大医学院 Alfred Sun 与 John Ouyang 为本研究的共同通讯作者。新加坡国立大学杜克国大医学院 Hilary Toh、Lisheng Xu 是本研究的共同第一作者。悉尼大学 Pengyi Yang、Carissa Chen 亦对本研究作出了重要贡献。

原文链接：www.science.org/doi/pdf/10.1126/sciadv.adu7944

Alfred Sun实验室4年前建于新加坡杜克国大医学院神经系，主要利用人类神经细胞，类脑模型等研究退行性神经疾病和神经发育疾病，同时也开发新的神经细胞模型，聚焦于最终的临床转化。欢迎有志同道合的同学和朋友加入。

制版人：十一

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