《食品科学》：中国农业大学江正强教授等：大肠杆菌利用葡萄糖生物合成D-阿洛酮糖的途径构建及优化

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，是自然界中天然存在但含量极少的一种稀有功能单糖。D-阿洛酮糖作为一种还原性的己酮糖，具有蔗糖70%的甜度，但仅有0.4 kal/g的能量值（蔗糖为3.89 kal/g），被认为是一种优良的蔗糖替代品。高效制备D-阿洛酮糖已成为研究热点。

D-阿洛酮糖的制备方法主要有化学法、酶法以及生物合成法。生物合成法是一种新兴的D-阿洛酮糖制备方法，通过调控生物体内代谢途径以廉价底物为原料发酵生产D-阿洛酮糖。相较于其他两种方法，生物合成法更具有经济性和高效精准性，是制备D-阿洛酮糖最有潜力的方法。

微生物合成D-阿洛酮糖的路径分为两种，一种是在酮糖3-差向异构酶作用下，通过“Izumoring”策略将D-果糖异构化为D-阿洛酮糖，通过增加D-果糖的转运及减少D-阿洛酮糖的消耗和外排，将D-阿洛酮糖产量提高至32.3 g/L。第二种路径是基于“磷酸化-去磷酸化”策略，将D-葡萄糖或D-果糖磷酸化后通过D-阿洛酮糖-6-磷酸3-差向异构酶（AlsE）将D-果糖-6-磷酸（F6P）转化为D-阿洛酮糖-6-磷酸（P6P），最后由阿洛酮糖-6-磷酸磷酸酶（A6PP）不可逆地将P6P转化为D-阿洛酮糖并排出细胞。

目前D-阿洛酮糖的生物合成主要针对通路构建、精准优化前体物质的供应以及保证辅因子的供给等策略，但D-阿洛酮糖的发酵产量水平较低。因此，提高合成通路中的关键酶A6PP的活性、平衡合成通路中基因表达强度等是提高D-阿洛酮糖产量和降低成本的关键。

中国农业大学食品科学与营养工程学院的姜雅文、张苍萍、江正强*等通过在大肠杆菌中过表达

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磷酸化-去磷酸化策略构建合成

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首先构建了“磷酸化-去磷酸化”策略合成D-阿洛酮糖的通路（图1a）。重组质粒pRSFDuet-alsE-hxpB和pETDuet-galp-glk分别导入大肠杆菌BL21（DE3）和大肠杆菌JM109（DE3）中，分别得到重组菌株BE-1和JE-1。结果表明，菌株BE-1和JE-1发酵48 h后都可以检测出D-阿洛酮糖，其中菌株BE-1产量较高，为0.29 g/L（图1b）。因此选择大肠杆菌BL21（DE3）作为本研究生物合成D-阿洛酮糖的初始底盘菌株。但BE-1和JE-1的OD600＜1.2，说明生长状况较差，说明D-阿洛酮糖合成通路的加强影响了重组菌株的正常生长，因此需要对BE-1生长及D-阿洛酮糖合成通路碳通量进行调整。

在大肠杆菌中理论上存在可以将D-葡萄糖转化为D-阿洛酮糖的合成通路。然而大肠杆菌BL21（DE3）和大肠杆菌JM109（DE3）在含有葡萄糖的M9培养基中发酵后并未检测到D-阿洛酮糖的生成。这是由于中间产物F6P的主要代谢途径是糖酵解，导致D-阿洛酮糖无法积累。D-葡萄糖可以被半乳糖/氢离子协同转运蛋白（GalP）转运，由葡萄糖激酶（Glk）磷酸化为D-葡萄糖-6-磷酸（G6P），将半乳糖/氢离子协同转运蛋白基因galp和葡萄糖激酶基因glk作为葡萄糖摄取模块，与D-阿洛酮糖生产模块（包括alsE和a6pp）共同加强表达，加强合成通路的碳通量，初步实现大肠杆菌利用葡萄糖合成D-阿洛酮糖。

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大肠杆菌生物合成

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敲除竞争代谢路径中酶基因对大肠杆菌生长及其合成D-阿洛酮糖产量的影响见图2。敲除了一系列与G6P、F6P和P6P代谢相关的内源性基因，包括磷酸果糖激酶A基因pfkA、磷酸果糖激酶B基因pfkB、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因zwf、磷酸葡萄糖变位酶基因pgm、阿洛糖-6-磷酸异构酶基因rpiB和甘露糖-6-磷酸异构酶基因manA，从而产生了携带质粒pRSFDuet-alsE-hxpB和pETDuetgalp-glk的菌株BE-2（大肠杆菌BL21（DE3）ΔpfkA）、BE-3（大肠杆菌BL21（DE3）ΔpfkB）、BE-4（BE-2Δzwf）、BE-5（BE-2Δpgm）、BE-6（BE-4ΔrpiB）和BE-7（BE-6ΔmanA）。结果表明，重组菌株BE-2的D-阿洛酮糖产量提升至0.38 g/L。重组菌株BE-4的D-阿洛酮糖产量提升至0.72 g/L，而重组菌株BE-5的D-阿洛酮糖的产量没有明显变化。重组菌株BE-6的D-阿洛酮糖产量提升至0.81 g/L，重组菌株BE-7的D-阿洛酮糖产量提升至0.95 g/L。此外，在敲除pfkA、zwf、pgm、rpiB和manA基因后，重组菌株的OD600均大于6，说明其恢复正常生长。

G6P、F6P和P6P是通过“磷酸化-去磷酸化”策略合成D-阿洛酮糖的3 个关键中间产物。大肠杆菌中F6P优先通过磷酸果糖激酶A和B（由pfkA和pfkB编码）转化为D-果糖-1,6-二磷酸而不是用于D-阿洛酮糖合成，因此分别敲除了pfkA和pfkB基因。由于pfkA基因所编码的磷酸果糖激酶A占磷酸果糖激酶活性的90%，因此敲除后更多的F6P用于D-阿洛酮糖的生产，从而提高了D-阿洛酮糖的产量。在合成过程中，葡萄糖的有效利用对于D-阿洛酮糖的合成至关重要。G6P可通过大肠杆菌中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和磷酸葡萄糖变位酶代谢进入戊糖磷酸途径和糖原合成途径，因此，基因zwf和pgm被进一步敲除，其中敲除zwf基因后，D-阿洛酮糖产量明显提升。P6P会被阿洛糖-6-磷酸异构酶（由rpiB编码）转化进入阿洛糖降解途径，因此可通过敲除rpiB基因防止P6P的降解，从而增加D-阿洛酮糖的产量。除此之外，甘露糖-6-磷酸异构酶（ManA）可以将F6P和D-甘露糖-6-磷酸可逆异构化，因此通过敲除manA基因防止碳代谢流失，增加D-阿洛酮糖的产生。在消除竞争通路相关基因后，本研究的重组菌株BE-7的D-阿洛酮糖产量明显提升至0.95 g/L。

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不同来源的A6PP对大肠杆菌生物合成

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将脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）来源的BfA6PP、诺氏拟杆菌（B. nordii）来源的BnA6PP、粪蝇科拟杆菌（B. faecichinchillae）来源的BfaA6PP、布氏拟杆菌（B. bouchesdurhonensis）来源的BbA6PP和粪拟杆菌（B. faecalis）来源的BfisA6PP分别替换重组菌种BE-7中的HxpB，构建重组菌BE8～BE12。摇瓶发酵结果如图3所示，重组菌株BE8～BE12生物合成的D-阿洛酮糖产量分别为1.16、1.19、1.08、1.21 g/L和1.05 g/L，且重组菌株生长状况良好（OD600＞6）。其中布氏拟杆菌来源的BbA6PP在发酵后D-阿洛酮糖产量最高，为1.21 g/L。

在“磷酸化-去磷酸化”策略中，由A6PP将P6P转化为D-阿洛酮糖为不可逆反应，因此高活性A6PP有利于反应的进行，进而提高D-阿洛酮糖的产量。筛选活性更高的A6PP对高效合成D-阿洛酮糖至关重要。Guo Qiang等选择了脆弱拟杆菌（B. fragilis）来源的A6PP，D-阿洛酮糖产量为0.07 g/L。Taylor等筛选了大肠杆菌对P6P具有潜在活性的磷酸酶，在大肠杆菌中可产生0.55 g/L的D-阿洛酮糖。本研究筛选的布氏拟杆菌来源的BbA6PP相较于其他已报道的A6PP而言具有更高的D-阿洛酮糖合成能力，构建的菌株BE-11生物合成D-阿洛酮糖产量达1.21 g/L，比重组菌株BE-7产量提高了27.4%。因此，利用菌株BE-11进行进一步优化。

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调节通路基因表达水平对大肠杆菌合成

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galp和glk基因可作为葡萄糖摄取模块，alsE和Bba6pp基因可作为D-阿洛酮糖生产模块，选用3 个不同拷贝数的质粒pCDFDuet-1（低拷贝）、pETDuet-1（中拷贝）和pRSFDuet-1（高拷贝）优化4 个基因的表达水平。将这两个模块的基因分别连接到不同拷贝数的质粒上，不同拷贝数重组质粒两两组合，分别导入底盘细胞中，获得5 个重组菌BE13～BE17（图4a）。摇瓶发酵结果如图4b所示，优化通路基因的转录水平后，D-阿洛酮糖的产量存在不同程度的提高，其中重组菌BE-14的D-阿洛酮糖产量最高，为2.06 g/L，且菌株生长状况良好（OD600＞5）。

大肠杆菌编码通路中的酶基因应当在适当平衡的水平上表达，以避免导致生长抑制或目标产物产量低的有毒中间产物积累。质粒拷贝数的优化是常用方法之一，成功地应用于改善脂肪酸、羟酪醇和2′-岩藻糖基乳糖的生产。在D-阿洛酮糖生物合成过程中，葡萄糖的摄取和阿洛酮糖的合成是实现D-阿洛酮糖高水平生产的关键。先前研究表明，D-阿洛酮糖生产模块基因alsE和a6pp以较高水平表达可以达到D-阿洛酮糖的最大产量。本研究通过优化质粒拷贝数，在高拷贝数质粒中表达葡萄糖摄取模块基因galp和glk、中拷贝数质粒中表达D-阿洛酮糖生产模块基因alsE和Bba6pp情况下有利于D-阿洛酮糖的合成，重组菌合成D-阿洛酮糖产量提升至2.06 g/L（图4b）。

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摇瓶发酵条件对重组菌株生物合成

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为进一步提高D-阿洛酮糖的发酵水平，进行工程菌株BE-14的发酵条件优化，结果见图5。葡萄糖添加量为25 g/L时，D-阿洛酮糖产量最高，为2.08 g/L（图5a），葡萄糖添加量为15 g/L时，菌株OD600最高，为7.75。IPTG浓度为0.2 mmol/L时，D-阿洛酮糖产量最高，为2.22 g/L（图5b），IPTG浓度为0.5 mmol/L时，菌株OD600最高，为7.79。BE-14在30 ℃和37 ℃条件下发酵，D-阿洛酮糖产量最高，分别为2.06 g/L和2.12g/L（图5c），而25 ℃时，D-阿洛酮糖产量及菌体OD600最低，为1.18 g/L和1.27。经过多因素组合优化，葡萄糖添加量为25 g/L、IPTG浓度为0.2 mmol/L和30 ℃发酵时D-阿洛酮糖产量最高，为2.72 g/L（图5d），比优化前提高了32%。

诱导剂浓度、底物浓度和培养温度等发酵条件在微生物发酵合成中具有重要作用。经单因素条件优化，发现当葡萄糖添加量为5～25 g/L时，随着葡萄糖添加量的增加，D-阿洛酮糖产量逐渐增加；葡萄糖添加量为30 g/L时的D-阿洛酮糖产量（2.05 g/L）与葡萄糖添加量为25 g/L时D-阿洛酮糖的产量（2.08 g/L）差别不大。葡萄糖是大肠杆菌生长的碳源和D-阿洛酮糖生物合成的底物，结果表明，随着葡萄糖添加量的增加，在保证菌株正常生长的情况下用于D-阿洛酮糖合成的葡萄糖逐渐增加，从而增加D-阿洛酮糖的产量；当葡萄糖添加量为25 g/L时，D-阿洛酮糖合成途径可能已达到其最大生产能力，此时进一步增加葡萄糖添加量（如30 g/L）不会继续提高D-阿洛酮糖产量。诱导剂IPTG是影响工程菌株生物合成D-阿洛酮糖的另一重要因素。适当的IPTG浓度不仅可以减轻再生核苷酸辅因子（ATP和三磷酸鸟苷）的代谢负担，而且可以平衡途径基因的表达水平，从而提高D-阿洛酮糖的产量。发酵温度优化显示，最适培养温度在30 ℃和37 ℃。Guo Yan等通过温度优化发现在25～37 ℃的生物催化活性和温度之间存在正相关，当温度继续升高达到50 ℃时，相对活性＜40%。因此适当的培养温度有利于酶的表达，进而提升D-阿洛酮糖的产量。因此，葡萄糖添加量为25 g/L、IPTG浓度为0.2 mmol/L时，在30 ℃发酵是工程菌株BE-14生物合成D-阿洛酮糖的最适发酵条件（图5d）。

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5 L发酵罐中分批补料精准发酵生物合成

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重组菌BE-14在5 L发酵罐进行了分批补料发酵实验，发酵结果如图6所示。发酵10 h后，OD600值达到27.3，此时加入IPTG和葡萄糖用于D-阿洛酮糖的合成。15～35 h菌体生长较缓，35 h后菌体OD600又迅速增加，发酵46 h时，D-阿洛酮糖的产量达到最高，为18.4 g/L。发酵液中仅存在微量葡萄糖（0.7 g/L）及果糖（0.1 g/L）残留（数据未显示）。

分批补料精准发酵能更好的体现重组菌株BE-14合成D-阿洛酮糖的能力。经分批补料发酵，重组菌BE-14合成D-阿洛酮糖的产量为18.4 g/L，是目前以葡萄糖为底物采用生物合成法的最高水平。诱导前菌株BE-14快速消耗葡萄糖用于菌体生长，细胞生长量达到峰值后处于稳定状态，说明菌体在发酵过程中生长状况较好。15～35 h菌体生长较缓，但D-阿洛酮糖生成速度明显加快，说明该阶段葡萄糖更多的用于D-阿洛酮糖的生物合成而不是细胞生长。35 h后菌体OD600又迅速增加，同时D-阿洛酮糖的合成速率降低并趋于平缓。Guo Qiang等采用以果糖为底物通过“Izumoring”策略生产D-阿洛酮糖，产量为32.33 g/L，但果糖残留多且菌株生长状况差。Taylor等采用全细胞催化法，通过过表达大肠杆菌内源AlsE和己糖醇磷酸酶B，D-阿洛酮糖产量达到15.3 g/L。本研究通过筛选高效A6PP等策略，保证菌株正常生长下进行D-阿洛酮糖的高效生物合成，产物中葡萄糖和果糖残留很少，有利于D-阿洛酮糖后续的提取及纯化。

结论

本研究在大肠杆菌BL21（DE3）中构建了“磷酸化-去磷酸化”途径合成D-阿洛酮糖的通路，敲除竞争途径相关基因（pfkA、zwf、rpiB和manA基因），更多的D-葡萄糖用于合成D-阿洛酮糖。挖掘出合成D-阿洛酮糖效果较好的布氏拟杆菌来源的BbA6PP。采用中拷贝质粒表达D-阿洛酮糖生产模块基因alsE和Bba6pp、高拷贝数质粒表达葡萄糖摄取模块基因galp和glk的重组菌株BE-14在分批补料精准发酵生产的D-阿洛酮糖产量为18.4 g/L，产物中仅存在微量葡萄糖及果糖。本实验对实现生物合成D-阿洛酮糖工业化生产具有一定现实意义。

作者简介

通信作者：

江正强，男，汉族，中共党员，中国农业大学食品科学与营养工程学院教授，博士生导师，长江学者特聘教授，国家杰出青年科学基金获得者。入选国家百千万工程有突出贡献中青年专家、国务院政府特殊津贴、国家“万人计划”领军人才、农业科研杰出人才及其创新团队、科技部中青年科技创新领军人才、光华工程科技奖、中国青年科技奖、教育部新世纪优秀人才、全国优秀百篇博士论文等。现为中国轻工食品生物工程重点实验室主任，中原食品实验室常务副主任，国家重点研发计划首席科学家。1995年参加工作，2004年晋升为教授。曾在日本、法国、德国等进行长期交流合作研究。现任中国农业工程学会农产品加工及贮藏工程分会理事长、中国食品科学技术学会酶制剂分会副理事长、中国发酵产业协会酶制剂和益生元分会副理事长、中国食品工业协会常务理事等，兼任《Food Chemistry》和《食品科学》等多种期刊编委。主要研究方向食品生物技术、食品酶与发酵工程、营养健康食品等。发表学术论文300多篇，其中SCI收录论文200多篇，著有专著6 部，授权发明专利70多项。荣获国家科技进步二等奖2 项、国家科技发明二等奖1 项、光华工程科技奖2 项、中国青年科技奖1 项和多项省部级奖励。

第一作者：

姜雅文，女，（1997—），中国农业大学博士，研究方向为食品合成生物学。

本文《大肠杆菌利用葡萄糖生物合成

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实习编辑：南伊；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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