N-1 摇瓶半连续瞬时灌流，用于台式生物反应器的超高密度接种

提高生物治疗药物产量的一种策略是在预培养（N-1阶段）中使用瞬时灌流，以超高细胞密度（>10 x 10^ 6 cells/ mL）接种生产培养物（N阶段）。这种极高的接种密度可以缩短培养时间并/或提高最终产品浓度，从而提高细胞培养性能。通常，N-1种子培养采用带有交替切向流过滤 (ATF) 或切向流过滤 (TFF) 灌流系统的生物反应器，或带有集成过滤膜的 Wave 细胞培养袋生物反应器，这些反应器成本高且技术复杂。本文，我们提出了一种替代方法，即通过在摇瓶中置换培养基进行半连续瞬时灌流，该方法适用于台式规模的强化工艺开发。为了防止营养限制，必须每日置换培养基。通过使用亚硫酸盐体系测量最大氧转移速率 (OTR)，证明了在不同尺寸的摇瓶中观察到的最大活细胞密度(VCD) 限制是由于氧气限制造成的。将搅拌频率从200 RPM提高到300 RPM，500 mL摇瓶中的最大OTR提高了62.3%，最大VCD也提高了29.6%。然而，在1000 mL摇瓶中，搅拌频率的提高会导致细胞早期死亡。在证明通过离心进行摇瓶培养基置换对细胞生长速率、代谢和生产力没有显著影响后，我们采用半连续瞬时灌流细胞扩增法接种了台式生物反应器。与标准低接种密度培养相比，超高细胞密度接种使时-空产量 (STY) 提高了49.3%。

简介

单克隆抗体 (mAb) 等生物治疗药物主要在配备 CHO 细胞表达系统的大规模补料分批生物反应器中生产。为了满足这些产品日益增长的需求，提出了三种方案：工艺强化、规模放大和规模扩展。规模放大哺乳动物细胞培养并非易事，这本身就包含与生产力和产品质量相关的风险。因此，包括规模扩展和工艺强化在内的提高生物制剂产量的替代方案正日益普及。规模扩展通常比规模放大更可行，因为添加额外的生物反应器比增加单个生物反应器的规模更容易，而且在资本成本方面也比规模放大更具成本效益。这使得随着需求的增长，更容易提高产能。工艺强化通常以实现高细胞密度的形式实现，是提高重组蛋白生产力的另一种方法。研究表明，以高达 20 × 10^6 cells/mL的超高接种密度 (UHSD) 来生产 mAb，可使最终滴度提高 3 倍，或使时-空产量 (STY) 提高 75%–132%（公式 1）。为了以如此高的细胞密度接种生物反应器，通常在 N-1 种子培养容器中以瞬时灌流模式培养细胞，以满足所需的大量细胞。

各种灌流系统均可用于UHSD细胞培养的N-1细胞扩增。传统灌流方法采用静态、动态或切向流(TF)，并结合膜(MB)过滤或无膜(non-MB)专用细胞截留系统。静态MB截留系统通常与摇摆式生物反应器一起使用，例如ReadyToProcess WAVE25及其Cellbag（Cytiva）或Biostat RM 20及其Flexsafe RM袋（Sartorius），它们通过动态混合有助于减少膜污染。动态BM截留系统（例如旋转滤器）的污染风险较低。然而，生物反应器内部的活动部件会增加污染风险；因此，置换这些部件不切实际，而且它们也不是一次性的。为了完全避免污染，人们使用了非MB方法，例如声学过滤、离心机和重力沉降器。然而，这些细胞截留系统也存在一些缺点，例如声学过滤器的可放大性有限、细胞损伤、聚集，以及需要专门的生物反应器设计才能进行离心，以及重力沉降器在次优培养条件下的长停留时间。由于这些限制，声学过滤器（主要的非MB细胞截留方法）自2014年以来很少在文献中报道。TF MB，例如交替切向流过滤 (ATF)（Refine Technology、Repligen 和 Artemis）和由低剪切离心磁力泵 (Levitronix) 驱动的切向流过滤 (TFF)，具有安装在生物反应器外部的优势，从而实现了细胞截留的模块化和可放大性。因此，ATF 和 TFF 灌流系统是用于 UHSD 细胞培养的 N-1 灌流的最常用的细胞截留装置。

由于台式生物反应器灌流设备的运行成本高，并且需要优化细胞特异性灌流速率 (CSPR)、灌流速率（每日容器体积，VVD）、补料和培养基组成以及细胞系稳定性和可放大性，因此有必要对灌流系统进行规模缩小。这些按比例缩小的模型通常通过在非仪器化摇管、摇瓶以及深孔板中进行半连续瞬时灌流来完成。在装液体积为 10–15 mL 的 50 mL 摇管中，观察到的最大活细胞密度为30-70 × 10^ 6 cells/mL。 在装液体积为25 mL（20%，体积/体积）的 125 mL 带挡板摇瓶中，在优化补料组成的情况下观察到的最大活细胞密度为 45 × 10^6 cells/mL。在 24 孔深孔板 (DWP) 中以 3 mL 的工作体积进行瞬时半连续灌流，可实现高达 95 × 10^6 cells/mL 的细胞密度。

研究了 50 mL 摇瓶中装液体积（5、10 和 30 mL）的影响，发现装液体积越大，细胞生长越慢。这些生长限制是由于氧气转移限制造成的。同样，预计在摇瓶中也会观察到这些氧气限制。摇瓶中可实现的最大氧转移速率 (OTR) 取决于搅拌速率、装液体积、摇动轨道直径、瓶直径和渗透压水平。在装液体积比例不变的情况下，增加摇瓶尺寸会导致 OTR最大值降低，因为体积增加速度快于瓶直径增加速度。此外，OTR 可能是后期对数增长、代谢活动、细胞密度的指标。这些指标很重要，因为生物反应器应该从具有高细胞代谢活动的对数增长细胞中接种。 N-1 培养需要高细胞密度来接种生产培养（N 阶段）。转移速率在线监测 (TOM, Kuhner Inc.) 装置已被证明可用于非侵入性监测摇瓶中的氧吸收速率 (OUR) 和碳转移速率 (CTR)，以确定细胞系行为的关键差异。另一个可能影响摇瓶中氧转移的因素是结构材料。材料的亲水性会影响搅拌过程中薄液膜的形成。亲水性材料（例如玻璃）会在表面形成一层薄薄的液体，从而允许气体转移，而疏水性材料（例如塑料）的润湿效率则不会那么高。然而，在哺乳动物细胞培养中（例如本研究中进行的培养），主要使用一次性无菌摇瓶来最大限度地降低污染风险。

在本文中，我们介绍了一种在摇瓶中进行半连续瞬时灌流（瞬时伪灌流）的简单而有效的方法，目的是将细胞接种到台式生物反应器中，用于 UHSD CHO 细胞培养生产重组蛋白。该方法是利用 cumate 诱导的 CHO-GS 克隆细胞系开发的，该细胞系真正实现了两阶段细胞培养。使用诱导系统可减轻细胞生长期蛋白质生产对细胞造成的代谢负担，从而实现更快的生长速度和更高的活细胞密度。在本研究中，我们还通过氧转移速率 (OTR) 测量证明，在达到氧转移限制之前，摇瓶中的活 CHO 细胞密度最高。

详细的实验操作和结果，请参考原文。

结果与讨论

行动时间研究

进行了行动时间研究，以确定摇瓶中半连续瞬时灌流首次培养基置换的合适时机。在 250 mL 挡板摇瓶中进行批次细胞培养，工作体积为 50 mL，初始活细胞密度为 0.2 × 10^6 cells/mL。每天监测活细胞密度 (VCD)、细胞活力和细胞倍增时间，以确定在哪个细胞密度下细胞活力开始下降或倍增时间开始增加，这表明培养物不再处于对数增长（图 1）。该细胞系在对数增长期间的历史细胞倍增时间平均为 18.6 ± 2.0 小时（n = 46）。选择 3.31 × 10^6 cells/mL 的 VCD 作为启动培养基置换的最大密度。观察到的倍增时间为21.09小时，在历史平均值的2个标准差范围内。因此，后续培养基置换在VCD为1.5–2.5 × 10^6 cells/ mL时开始，以确保在细胞进入对数生长期后期和平台期之前开始。对数生长期末期的细胞密度为3.31 × 10^6 cells/ mL，这与文献中的观察结果一致，摇瓶中的批次CHO细胞培养通常在4–6 × 10^6 cells/mL时达到对数生长期后期。

图 1. 摇瓶半连续瞬时灌流培养液置换起始时间的行动时间研究。250 mL摇瓶中50 mL批次细胞培养的活细胞密度（蓝色）、细胞活力（红色）和细胞倍增时间（绿色）。绿色区域代表活力维持在98%以上时的细胞密度，以及细胞处于对数增长状态时的细胞密度，如相应的倍增时间所示。

培养基置换频率的影响

在细胞扩增期间，每 2-3 天进行一次细胞培养传代，以确保细胞处于对数生长期。第一次摇瓶培养基置换实验只是用培养基置换代替了细胞稀释。在这种情况下，细胞稀释和培养基置换的目的相同：去除代谢废物（如乳酸和氨），补充营养物质（如葡萄糖、关键氨基酸和其他底物）。首先使用 125 mL 无挡板摇瓶测试间歇性培养基置换(IME) 的效果（在第 0、2、4 和 7 天进行），起始 VCD 为 1.5-2.5 × 10^6 cells/mL（图 2a和b）。从第 0 天到第 4 天，细胞活力保持在 >98%，VCD 为 20.3 × 10^6 cells/mL，这代表倍增时间为 30.66 小时。由于细胞生物质积累导致的倍增时间延长是预料之中的，之前已经在灌流培养中观察到并建模。第7天，细胞生长率大幅下降，倍增时间为 47.88 小时，细胞活力下降至 80.4%。细胞活力的下降可以用第 7 天的葡萄糖耗尽来解释。该细胞系在细胞生长期的特定葡萄糖消耗率约为 1 pmol/cell/day。按照这个消耗率和第 7 天的估计 VCD，需要的葡萄糖浓度约为 80 mM。然而，据报道高葡萄糖浓度（>55 mM）会降低细胞生长率。为了解决这个问题并保持低葡萄糖浓度而不耗尽，每天在 125 mL 无挡板摇瓶中进行培养基置换(DME)，从第 0 天开始以 1.5–2.5 × 10^6 cells/mL 的细胞密度置换培养基（图 2a、b）。通过每日培养基置换 (DME)，葡萄糖浓度成功维持在 6 至 45 mM 之间，细胞活力高达 > 98%，峰值 VCD 为 65.5 ± 7.2 × 10^6 cells/mL（n  = 2）在第 7 天达到，倍增时间为 30.1 ± 1.2 小时（n  = 2）。虽然在第 7 天和第 8 天之间没有观察到细胞生长，但也没有检测到明显的活力损失。

图 2. 摇瓶中进行的培养基置换频率的影响。（a）125 mL 无挡板摇瓶中，（a）活细胞密度和（b）每日培养基置换（DME，绿色 −●-）和培养基置换取代细胞传代（IME，红色 −●-）的细胞活力；（c）无挡板摇瓶（DME，绿色 −■-）、无挡板摇瓶（DME_D3，蓝色 −■-）中从第 3 天开始的每日培养基置换以及 250 mL 摇瓶中（DME_D3，红色 −■-）中从第 3 天开始的每日培养基置换的活细胞密度和（d）细胞活力；（e）活细胞密度和（f）在 200 RPM 搅拌的无挡板摇瓶中每日培养基置换的细胞活力（DME，绿色−▲-），在 200 RPM 搅拌的无挡板摇瓶中从第 3 天开始的每日培养基置换（DME_D3，蓝色−▲-），在 120 RPM 搅拌的无挡板摇瓶中从第 3 天开始的每日培养基置换（DME_D3，橙色−▲-），以及在 120 RPM 搅拌的有挡板摇瓶中从第 3 天开始的每日培养基置换（DME_D3，红色−▲-），适用于 1000 mL 摇瓶。DME 指每日培养基置换；IME 指用培养基置换代替细胞传代的间歇性培养基置换； DME_D3 指的是第 0 天的培养基置换和从第 3 天开始的每日培养基置换。重复的误差线代表最小值和最大值，而四次重复的误差线代表重复的标准偏差。

在 250 mL 摇瓶（图 2c、d）和 1000 mL 摇瓶（图 2e、f）中进行了每日培养基置换 (DME) 的半连续瞬时灌流细胞扩增过程。第 7 天的最大细胞密度为 56.1 ± 7.1 × 10^6 cells/mL（n  = 4），第 6 天的最大细胞密度为 33.7 ± 2.9 × 10^ 6 cells/mL（n  = 2），细胞活力 > 98%。由于摇瓶中的 OTR 是瓶大小有关，较大瓶中最大 VCD 的降低被怀疑是由于氧转移限制（本研究进一步证实）。因此，将无挡板摇瓶换成有挡板摇瓶，已知有挡板摇瓶可增加 OTR。最初，为了减少培养过程中的培养基消耗，在第 1 天和第 2 天，当 VCD 足够低以至于葡萄糖不会在此时间段内耗尽时，没有进行培养基置换，如在 125 mL 摇瓶培养中所见。然而，这些条件导致 250 mL 和 1000 mL 挡板摇瓶中细胞在第 3 天后早期死亡（图 2c-f）。由于挡板摇瓶中细胞早期死亡，最大 VCD 明显低于每天置换培养基的无挡板摇瓶。在第 1 天和第 2 天未置换培养基的挡板摇瓶培养中观察到的细胞过早衰退归因于剪切应力，而不是营养限制。这一结论得到了在第 1 天和第 2 天使用未进行培养基置换的无挡板摇瓶进行的实验的支持，实验在 250 mL 摇瓶（图 2c、d）和 1000 mL 摇瓶（图 2e、f）中进行。这与文献中观察到的在长时间暴露于较高剪切应力环境后在带挡板的摇瓶中细胞死亡的情况一致。第7天的最大细胞密度分别为 53.2 ± 3.0 × 10^ 6 cells/mL（n  = 2）和 27.4 × 10^ 6 cells/mL，细胞活力 > 93%。为了进一步证明氧气限制的影响，在以 120 RPM 的较低轨道搅拌速率搅拌的 1000 mL 摇瓶中进行培养基置换细胞培养（图 2e、f）。尽管细胞活力维持在 98% 以上，但第 5 天的最大 VCD 仅为 19.7 × 10^ 6 cells/mL。这一观察结果符合预期的氧转移限制。

从测量的 20 种蛋白质形成氨基酸来看，在摇瓶中半连续瞬时灌流并置换培养基的过程中，仅观察到天冬酰胺 (Asn) 和谷氨酰胺 (Gln) 的消耗 (补充图 1 )。在 250 和 1000 mL摇瓶中进行的每日培养基置换 (DME) 和省略第 1 天和第 2 天的每日培养基置换 (DME_D3) 中，谷氨酰胺水平在整个细胞培养过程中保持在较低水平，在培养结束时略有升高 (图 3a )。低谷氨酰胺水平是 CHO-GS 细胞的典型特征，由于谷氨酸合成酶的表达，CHO-GS细胞可以从谷氨酸和氨合成谷氨酰胺。值得一提的是，CHO 细胞中内源性 GS 表达通常较低。因此，如前所述，在为CHO-GS 细胞配制的培养基和补料中未添加额外的谷氨酰胺。产生的少量谷氨酰胺会被细胞迅速消耗，导致在细胞培养中暂时检测到较低的残留水平。此外，频繁的培养基置换也可以防止其积累。当在第 1 天和第 2 天省略培养基置换时，在 250 和 1000 mL摇瓶中观察到天冬酰胺在第 3 天耗尽（图 3b）。谷氨酰胺和天冬酰胺可以被细胞互换使用，它们在细胞对数生长早期尤为重要，因为它们为 TCA 循环贡献碳源和氮源。天冬酰胺通过天冬酰胺酶转化为天冬氨酸进入 TCA 循环，然后在谷氨酸-草酰乙酸转氨酶 1 的催化下转化为草酰乙酸，为 TCA 循环的总碳通量做出贡献。尽管谷氨酰胺和天冬酰胺可以互换用作 TCA 循环的营养来源，但在 DME_D3 半连续瞬时灌流细胞培养中，这两种氨基酸都会在第 3 天迅速耗尽，因为第 1 天和第 2 天没有供应营养物质。此外，天冬酰胺被证明对CHO-GS 细胞生长至关重要，其缺乏会导致细胞生长停滞。天冬酰胺耗尽的 DME_D3 细胞培养物的生长停滞也可以通过 OTR 增加速度减慢来证实，预计 OTR 在第 3 天之前与 VCD 成正比，然后在第 3 天培养基置换后恢复。由于细胞密度升高，在 250 mL 摇瓶中也观察到 DME 和 DME_D3 培养基置换计划中的天冬酰胺耗尽。然而，可以与天冬酰胺同时使用的谷氨酰胺在第 5 天不会完全耗尽。

图 3. 250 和 1000 mL 摇瓶中的 L-谷氨酰胺和 L-天冬酰胺动力学曲线。（a）250 mL 摇瓶（绿色 −●-）和 1000 mL 摇瓶（橙色 −▲-）中每日置换培养基(DME) 的半连续瞬时灌流细胞培养中的残留谷氨酰胺和（b）残留天冬酰胺，250 mL 摇瓶（蓝色 −■-）和 1000 mL 摇瓶（红色 −▼-）中省略第 1 天和第 2 天的每日培养基置换 (DME_D3)。

摇瓶尺寸对半连续瞬时灌流的影响

使用 125、250、500 和 1000 mL 摇瓶（每个瓶的容量为最大标称容量的 20%）评估了摇瓶大小对最大 VCD 和氧转移限制的影响（图 4）。在半连续瞬时灌流培养过程中，使用 TOM 系统监测 OTR。为了最大限度地提高 VCD，培养物在无挡板摇瓶中以 200 RPM 的速度搅拌，从第 0 天开始每天置换培养基，这基于之前培养基置换优化研究的频率。在细胞对数生长期间，所有摇瓶大小的细胞活力都保持在 >98%（图 4）。观察到的最大 VCD 和 OTR 与摇瓶大小成反比（表 1）。最大 VCD 与最大 OTR 成正比，表明每个摇瓶中达到最大细胞密度时细胞的特异性呼吸速率相同，均为 2.8 ± 0.2 pmol/cell/day。对于 CHO 细胞，该特异性呼吸速率值在1-10 pmol/cell/day的预期范围内。在整个细胞培养过程中观察到的 OTR 曲线遵循限氧细胞培养的预期趋势，其中 OTR 在细胞生长过程中增加，直至达到稳定状态并维持一段时间。

图 4. 培养瓶大小对细胞生长和氧转移速率 (OTR) 曲线的影响。(a) 细胞活力、(b) 活细胞密度和 (c) 每日完全置换培养基后细胞培养物的氧转移速率 (OTR)。横线表示每种培养瓶大小观察到的最大 OTR (c)。细胞培养在 125 mL（绿色 −●-）、250 mL（蓝色 −●-）、500 mL（橙色 −●-）和 1000 mL（红色 −●-）无挡板培养瓶中进行，装液量为 20%，搅拌速度为 200 RPM。重复实验的误差线代表最小值和最大值，四次重复实验的误差线代表重复实验的标准差。对 250 mL 和 500 mL 培养瓶进行了两次 OTR 测量 [ n  = 2]。

公式 7可以估算摇瓶中的最大 OTR，它是渗透压 (Osmol)、搅拌速率 (n)、操作体积 (V L )、摇瓶直径 (d)、轨道摇晃直径 (d 0 )、操作压力 (p R ) 和氧摩尔分数 (y O2 ) 的函数。尽管该公式对于细菌细胞培养的误差非常小，为 ±5 mmol/L/h，但它无法确定观察到的最大 OTR 是否是由于目前哺乳动物细胞培养中的氧转移限制造成的。这种相关性是针对细菌创建的，细菌的耗氧率比哺乳动物细胞高得多。由于本研究测得的最大 OTR 处于该相关性适用范围 (0-80 mmol/L/h) 的下限 (4-8 mmol/L/h)，因此该误差使得无法确定不同大小的摇瓶在理论上是否会导致显着不同的最大 OTR。

使用亚硫酸盐系统测量最大 OTR，以确认氧转移限制，而不是营养耗尽或代谢废物积累等其他因素，导致了在培养基置换细胞培养中观察到的最大 OTR（图 4c ）。为此，使用亚硫酸钠模拟快速氧气消耗，因为它在硫酸钴 (II) 的催化下以足够高的速率转化为硫酸钠，因此 OTR 被认为是限速步骤。使用亚硫酸盐系统在 20% 装液体积下测量的 125、250、500 和 1000 mL 摇瓶的最大 OTR 与摇瓶大小成反比（表 2，参见原文）。将亚硫酸盐体系（无细胞）测得的最大OTR值与生物体系中观察到的最大OTR值进行比较，后者是在200 RPM的摇瓶中每日置换培养基时达到的最大OTR值（图 4c）。这些最大OTR值（无细胞亚硫酸盐体系）与生物体系中每日置换培养基时观察到的最大OTR值相比，存在2%-26%的差异（表 2）。

亚硫酸盐体系和生物体系测得的最大氧通量 (OTR) 之间存在差异。这种差异部分归因于溶液渗透压和扩散系数的差异。尽管在不同浓度的亚硫酸钠下，培养基和亚硫酸盐体系之间存在差异，但研究表明，0.35 M 浓度的亚硫酸钠具有与培养基相当的气体转移动力学。因此，使用0.35 M 浓度的亚硫酸钠来缩小生物体系最大氧通量(OTR) 和亚硫酸盐体系最大氧通量(OTR) 之间的差异。此外，为了测量亚硫酸盐体系的最大氧通量 (OTR)，必须将反应动力学调整为“非加速”反应模式，这使得液体侧边界层中氧气和亚硫酸盐的反应几乎可以忽略不计。这使得大部分氧气在本体液体中被消耗，类似于生物体系，其中氧气转移发生在摇瓶表面形成的液膜上，而氧气消耗发生在本体液体中。使用浓度为 10 −7  M 的硫酸钴 (II) 催化剂可实现与亚硫酸盐体系的“非加速”反应。因此，通过 OTR 曲线的总体趋势和最大摇瓶 OTR 的亚硫酸盐体系测量结果显示，由于氧气转移限制，该 CHO 细胞系的最大细胞密度是在摇瓶中达到的。

轨道振摇速度对细胞生长和OTR的影响

研究表明，通过氧转移可以达到最大可持续 VCD，因此，要通过半连续瞬时灌流在摇瓶中达到更大的 VCD，需要增加系统的最大 OTR。可以通过添加挡板来增加摇瓶的 OTR，因为这会引起更大的湍流。然而，研究表明，添加挡板会导致细胞活力早期下降（图 2）。也可以通过减少操作体积、增加摇动直径或增加摇动频率来增加摇瓶的最大 OTR（公式 7）。选择摇动频率来增加最大 OTR，因为摇动直径对最大 OTR 影响较小。另一方面，减少操作体积会减少半连续瞬时灌流产生的细胞总量，这违背了台式生物反应器接种细胞扩增的目的。对于500 mL和1000 mL培养瓶，摇动频率从200 RPM增加到300 RPM，进行半连续瞬时灌流，并每日置换培养基（图 5）。在500 mL培养瓶中，摇动频率的增加导致观察到的最大OTR为4.99 mmol/L/h至8.10 mmol/L/h。最大OTR的增加使最大VCD从200 RPM时的46.7 ± 3.9 × 10^ 6 cells/mL（n  = 4）改善到300 RPM时的60.5 ± 0.2 × 10^ 6 cells/mL（n  = 2）。然而，对于 1000 mL 摇瓶，摇动速率的增加并未导致最大 VCD 和最大 OTR 的上升，因为细胞活力在第 4 天后开始下降。由于观察到细胞活力早期下降，1000 mL 摇瓶中以 300 RPM 进行的细胞培养提前终止。

图5. 轨道摇动速度对细胞生长和 OTR 的影响。（a）细胞活力、（b）活细胞密度和（c）进行每日完全培养基置换的细胞培养物的氧转移速率 (OTR)。细胞培养在无挡板摇瓶中以 200 和 300 RPM 的摇动频率进行：500 mL 300 RPM（绿色 −●-），500 mL 200 RPM（蓝色 −●-），1000 mL 200 RPM（橙色 −●-），1000 mL 300 RPM（红色 −●-）。重复实验的误差线代表最小值和最大值，四次重复实验的误差线代表重复实验的标准差。由于技术问题， 500 mL 摇瓶在 200 RPM 下的 OTR 测量（蓝色曲线，c）重复进行 [ n = 2]。

摇动速度增加会导致摇瓶中的剪切应力增加。此外，与较小的摇瓶相比，体积较大（因此瓶直径较大）的摇瓶在相同摇动频率下受到的剪切应力水平更高。当摇瓶尺寸从500 mL变为1000 mL时，平均能量耗散率增加1.6倍；当搅拌速度从 200 转/分增加到 300 转/分时，平均能量耗散率增加 3.2 倍（表 3，参见原文）。Kolmogorov 长度表示混合时形成的较小涡流的大小。当这些涡流的尺寸小于细胞尺寸时，可能会发生细胞损伤。在1000mL摇瓶中，估计 Kolmogorov 长度为 13.6 μm，低于 CHO 细胞平均直径 15 μm。因此，1000 mL摇瓶在 300 RPM 转速下的细胞死亡很可能是由于长时间暴露在高剪切应力条件下造成的。

半连续瞬时灌流对细胞倍增时间和生产力的影响

为了确定培养基置换对细胞生长率的影响，对在 125 mL 摇瓶中以 20% 装液体积（25 mL）以 300 RPM 摇动培养的细胞从 2 × 10^ 6 cells/mL 开始每天置换培养基（标记为“Run 1”）。当达到 40 × 10^6 cells/mL 时，将细胞稀释回 2 × 10^6 cells/mL，再次每天置换培养基，直到细胞达到 40 × 10^6 cells/mL 以上（标记为“Run 2”）。在 Run 1 和 Run 2 的细胞扩增过程中，细胞活力均保持在 > 98%（图 6b）。Run 1 和 Run 2 的生长曲线重叠（图 6a），表明通过每天完全置换培养基在摇瓶中进行半连续瞬时灌流对细胞生长率没有短期影响。此外，半连续瞬时灌流细胞扩增的第 1 次运行和第 2 次运行中，残留葡萄糖和乳酸水平以及特定葡萄糖消耗量和乳酸产量相当（图 6c-f）。

图 6. 每日置换培养基对摇瓶细胞生长性能的影响。在 125 mL 无挡板摇瓶中，以 20% 的装液体积在 300 RPM 的转速搅拌下进行每日培养基置换时，运行 1（绿色 −●-）和运行 2（蓝色 −●-）的活细胞密度、(b) 细胞活力、(c) 残留葡萄糖、(d) 乳酸、(e) 细胞特异性葡萄糖消耗和 (f) 细胞特异性乳酸生成。运行 1 是指从解冻细胞进行的半连续瞬时灌流细胞扩增。运行 2 是指在第 5 天从运行 1 细胞进行的半连续瞬时灌流细胞扩增，达到>40 × 10^6 cells/mL。

为了确定每日培养基置换对培养生产力的影响，在相同条件下使用不同的种子培养物在摇瓶中进行了两次细胞培养。其中一个摇瓶使用标准细胞扩增 (SCE) 接种，通过稀释细胞将活细胞密度保持在 0.2 至 3 × 10^ 6 cells/mL 之间，使细胞保持对数增长。第二个摇瓶接种来自半连续瞬时灌流 (STP) 的细胞，其中细胞从第 0 天的 2.2 × 10^6 cells/mL 开始每日置换培养基，直到第 5 天细胞达到 >40 × 10^ 6 cells/mL。将细胞稀释至 2 × 10^6 cells/mL，并每日置换培养基，直到第 11 天细胞达到 56 × 10^6 cells/mL（图 6a）。从 SCE 和 STP 接种的摇瓶细胞培养物在生长期直至 2 DPI 均具有相当的生长率。在整个生产阶段（2-14 DPI），两种培养物的VCD下降幅度相当（图 7a）。接种SCE和STP的细胞培养物的细胞特异性生产力相似（图 7b）。由于特异性生产力和VCD相当，两种细胞扩增方法接种的培养物的体积产物滴度也相似。这些结果表明，STP对细胞生长和糖酵解代谢没有明显影响（图 6），并且它不影响细胞生长和活力以及细胞特异性生产力和体积mAb生产力（图 7）。

图 7. 每日培养基置换细胞扩增对摇瓶补料分批生产的影响。（a）活细胞密度和细胞活力，以及（b）通过标准细胞扩增（SCE）和半连续瞬时灌流（STP）接种的 125 mL挡板摇瓶中的细胞培养物的体积产物滴度和细胞特异性生产率。

提高接种密度的改进

为了证明通过每日培养基置换的摇瓶中的 STP 可用于在高细胞密度下接种台式生物反应器，将 STP N-1 种子菌株以超高接种密度 (UHSD) (15 × 10^6 cells/mL)接种到 1 L 容器中。将 SCE N-1 种子菌株以标准接种密度 (SSD) (0.3 × 10^6 cells/mL) 接种到第二个 1 L 台式生物反应器中。UHSD 过程在诱导时以 15 × 10^6 cells/mL 开始，而 SSD 过程在诱导时仍仅为 ~5 × 10^6 cells/mL。SSD 达到 ~15 × 10^6 cells/mL 的时间比 UHSD 工艺晚 2 天（图 8a）。这两个工艺的活力均维持在 >95% 左右，持续约 5 天（图 8b）。 UHSD 工艺较早达到细胞活力峰值，但细胞活力下降也较早，这是高密度接种工艺的典型特征，正如之前在高接种密度研究中观察到的那样。与SSD工艺相比，在细胞培养中更早达到高VCD 可缩短UHSD 工艺的细胞培养时间。高密度接种工艺在 6 天内生产出 1206 mg/L 的 mAb，而标准工艺在 12 天内生产出 1616 mg/L。对于一个时间相差了 50% 的工艺来说，这仅意味着产品浓度损失了25.4%。因此，UHSD 工艺的时-空产量 (STY) 为 201 mg/L/day，而 SSD 工艺的 STY 仅为 135 mg/L/天，STY 增加了 49.3%。 UHSD 工艺中培养时间的缩短是通过绕过诱导前生长阶段（-3 至 0 DPI）并以更高的细胞密度开始生产阶段（0 至 2 DPI）来实现的，从而可以更早地达到生产高峰。UHSD 培养可以进一步优化，但这不在本研究的范围内。这些未来的优化措施可以包括：强化补料方案；添加短链脂肪酸（例如丁酸钠、戊酸或丙戊酸，这些物质已被证明可以抑制细胞生长并提高细胞特异性生产力）；实时血糖监测以实现低血糖水平控制策略；以及补充关键氨基酸。

图8. 超高接种密度 (UHSD) 对补料分批生物反应器生产性能的影响。1 升台式生物反应器中超高接种密度(UHSD) (绿色 −●-) 和标准接种密度 (SSD) (红色 −●-) 细胞培养的 (a) 活细胞密度、(b) 细胞活力、(c) 体积产品滴度和 (d) 细胞特异性滴度。

结论

本研究的主要目标是在N-1预培养条件下，使用摇瓶接种超高细胞密度的台式生物反应器，从而降低工艺成本并简化工艺流程。此外，通过与SSD工艺进行比较，证明了UHSD工艺的改进。

N-1 种子培养的开发旨在模拟瞬时灌流（例如通常使用ATF/TFF 灌流系统进行的操作），以达到能够接种台式生物反应器的15 × 10^6 cells/mL的活细胞密度。通过在摇瓶中置换培养基进行的半连续瞬时灌流用于模拟生物反应器中的瞬时灌流。该开发的第一步是确定必要的培养基置换频率。结果表明，在较低的频率（每 2-3 天一次）下，总葡萄糖消耗量会变得足够高，以至于葡萄糖会被耗尽，或者需要足够高的葡萄糖浓度来抑制细胞生长。为了达到最高的活细胞密度，需要从第 0 天开始每天置换培养基，初始培养基浓度为1.5-2.5 × 10^6 cells/mL。事实上，如果在第 1 天和第 2 天不置换培养基以减少培养基消耗，由于营养限制，最终达到的最大活细胞密度会更低。

随后，通过使用 TOM 仪器（Kuhner Shaker Inc.）对细胞培养物进行 OTR 测量，结果表明，当氧气成为限制性营养物质时，达到最大细胞密度。使用亚硫酸盐系统测量的最大 OTR 证实，在 125、250、500 和 1000 mL 摇瓶中，当装液量为 20% 且摇动速度为 200 RPM 时，细胞培养物可达到氧限制性的活细胞密度。对于 500 mL 摇瓶，将摇动速度从 200 RPM 提高到 300 RPM 可使最大 OTR 从 4.99 增加到 8.10，从而使最大 VCD 提高 29.6%。然而，对于 1000 mL 摇瓶，将摇动速度从 200 RPM 提高到 300 RPM 会导致细胞早期死亡，从而降低最大 VCD。早期细胞死亡的原因是较大的摇瓶在较高的摇动速率下存在较高的剪切应力。由于在1000 mL摇瓶中，200 RPM时细胞活力不会受到负面影响，但在300 RPM时会受到影响，因此可以进一步优化该摇瓶的摇动速率（在200至300 RPM之间），以找到不影响细胞活力的最大OTR。

摇瓶中的半连续瞬时灌流已成功用作 1 L 台式生物反应器超高密度接种的 N-1 预培养，从而无需昂贵且专用的灌流设备。在台式生物反应器细胞培养中使用超高接种密度（15 × 10^6 cells/mL）可获得标准接种密度（0.3 × 10^6 cells/mL）的 87% 的体积性产物滴度。然而，与 SSD 细胞培养相比，UHSD 细胞培养的培养时间缩短了 50%。更短的培养时间加上相当的体积性产物滴度使时-空产量提高了 49.3%。STY 的增加主要是由于消除了N阶段生产之前的生长期。当考虑到这个生长期时间时，由于达到的最终滴度相当，时空产量的差异要小得多。尽管如此，文献表明，通过进一步优化，在高密度接种培养中可以实现更高的滴度。最后，使用 N-1 灌流种子培养可以缩短 N 阶段生产生物反应器的使用时间，从而实现更好的设备灵活性和更高的资产周转率。

原文：L. Lemire, S. Reyes, Y. Durocher, et al., N-1 semi-continuous transient perfusion in shake flask for ultra-high density seeding of CHO cell cultures in benchtop bioreactors. Biotechnology Progress, 2025.