同济大学任杰教授ACS Nano：新型“特洛伊木马”纳米疗法突破肿瘤代谢免疫治疗瓶颈

肿瘤代谢重编程是恶性肿瘤的重要特征之一，使癌细胞能够在营养匮乏的微环境中生存和增殖。然而，当前针对代谢的干预策略往往忽视了代谢重编程所导致的免疫抑制肿瘤微环境。在这一环境中，癌细胞通过与免疫细胞竞争营养物质，削弱了T细胞的活化和增殖能力，并促进巨噬细胞向促癌的M2表型极化，从而阻碍有效的抗肿瘤免疫应答。因此，如何通过靶向代谢途径恢复免疫细胞的杀伤功能，成为当前癌症治疗中的重要挑战。

近日，同济大学任杰教授、美国南密西西比大学Qiang Zhe提出了一种名为“线粒体特异性‘特洛伊木马’纳米平台（2-pN@LNPs）”的创新策略。该平台共载线粒体解偶联剂尼克酰胺（Nic）和糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖（2-DG），通过双重靶向线粒体代谢和糖酵解途径，协同引发肿瘤细胞焦亡，并重塑抗肿瘤免疫。研究表明，该纳米颗粒能够促使质子渗入线粒体内膜，导致氧化磷酸化进入无效循环，同时利用肿瘤细胞对葡萄糖的高需求递送2-DG，引发糖酵解崩溃。在细胞及三维肿瘤球体模型中，2-pN@LNPs展现出显著的协同治疗效果，引起线粒体功能障碍、活性氧积累和ATP耗竭，最终诱导焦亡样细胞死亡。此外，该治疗还促进了细胞毒性T细胞与辅助T细胞的浸润、M1型巨噬细胞极化，并建立起长期免疫记忆，有效抑制肿瘤复发与转移。相关论文以“Mito-Specific “Trojan Horse” Nanotherapy: Synergistic Antitumor Immunotherapy via Dual Modulation Mitochondrial Metabolism and Glycolysis”为题，发表在ACS Nano上，论文第一作者为Yang Jingjing。

研究人员首先设计了具有线粒体靶向（TPP修饰）和肿瘤靶向（RGD肽修饰）的脂质-聚合物杂化纳米平台。该平台通过自组装形成均匀的球形结构，粒径约为235纳米，表面带负电，并表现出良好的血液相容性和pH响应性药物释放特性。在细胞实验中，纳米颗粒可高效被4T1癌细胞摄取，并深入三维肿瘤球体内部，显示出优异的穿透能力。进一步的细胞毒性实验表明，2-pN@LNPs在极低浓度下即可实现半数抑制，其效果显著优于单一药物治疗组，并通过活/死染色与结晶紫染色验证了其强大的肿瘤杀伤能力。此外，该纳米颗粒还能有效抑制癌细胞的迁移与侵袭行为，预示其具备抑制肿瘤转移的潜力。

示意图1 线粒体特异性2-pN@LNPs纳米制剂的制备示意图及其通过调制线粒体代谢和糖酵解途径在协同抗肿瘤免疫治疗中的应用。

图1 （a）2-pN@LNPs的制备过程示意图。（b）LNPs（RGD）、LNPs（TPP）和LNPs（RGD/TPP）的流体动力学直径和（c）zeta电位。（d）LNPs（RGD/TPP）的NS-TEM图像。比例尺：100 nm。（e）2-pN@LNPs的流体动力学直径、（f）zeta电位和（g）NE-TEM图像（比例尺：100 nm）。（h）不同浓度2-pN@LNPs的溶血测定。（i）不同pH值下pN@LNPs中p-Nic的累积药物释放。（j）pH=7.4时药物释放后pN@LNPs的NE-TEM图像（比例尺：200 nm）。

图2 （a）Cy7.5标记的LNPs在4T1细胞中不同时间点的共聚焦显微镜图像。比例尺：10 µm。（b）流式细胞术检测4T1细胞对Cy7.5标记LNPs的摄取。（c）三维4T1多细胞肿瘤球体对Cy7.5标记LNPs的摄取图像。比例尺：100 µm。（d）2-DG与2-DG@LNPs、（e）Nic与pN@LNPs、以及（f）Nic/2-DG与2-pN@LNPs处理后的细胞活力测定（IC50值基于Nic含量计算）。（g）纳米制剂处理后4T1细胞的结晶紫染色。（h）4T1细胞活/死染色（Calcein AM/PI）。比例尺：100 µm。（i）经2-pN@LNPs处理与否的三维4T1肿瘤球体活/死染色。比例尺：100 µm。（j）Transwell迁移与侵袭实验示意图。（k）不同处理组迁移细胞图像与（l）侵袭细胞图像。

在机制层面，研究团队发现2-pN@LNPs处理可引起细胞内活性氧爆发、NAD+/NADH比率上升、线粒体膜电位崩解及ATP水平急剧下降，表明其通过双重阻断能量代谢通路引发严重的能量危机。透射电镜图像进一步显示，经2-pN@LNPs处理的细胞出现线粒体肿胀、嵴结构消失等焦亡样形态特征，同时Western blot检测到GSDME-N蛋白切割，确认了焦亡通路的激活。这些变化共同导致肿瘤细胞发生免疫原性死亡，释放钙网蛋白（CRT）和高迁移率族蛋白B1（HMGB1）等损伤相关分子模式，进而激活树突状细胞的成熟，并促进炎症因子IL-6和TNF-α的分泌。

图3 （a）4T1细胞经DCFH-DA（比例尺：100 µm）和DHE（比例尺：20 µm）染色后的ROS检测。（b）DCFH-DA与（c）DHE染色的流式细胞术定量分析。（d）三维4T1肿瘤球体ROS检测。比例尺：100 µm。（e）不同纳米制剂处理后细胞内NAD+/NADH比率分析。（f）JC-1探针染色后线粒体膜电位分析（比例尺：10 µm）。（g）细胞内ATP含量检测。（h）不同纳米制剂处理后4T1细胞的Bio-TEM图像（比例尺：2 µm）及局部放大图（比例尺：1 µm）。（i）2-pN@LNPs诱导细胞死亡机制示意图。

图4 （a）CRT表达的共聚焦显微镜图像和（c）HMGB1表达图像。比例尺：10 µm。（b）CRT表达与（d）HMGB1表达的平均荧光强度定量分析。（e）未成熟树突状细胞培养及与纳米制剂处理后的4T1细胞共培养后成熟DC检测流程示意图。（f）流式细胞术图像及（g）成熟DC细胞的定量分析。（h）上清液中IL-6与（i）TNF-α水平检测。（j）垂死癌细胞诱导DC成熟的机制示意图。

在动物模型中，2-pN@LNPs治疗显著提升了脾脏中CD4+与CD8+ T细胞的比例，并增加了中央记忆T细胞的数量，说明其能够激活并维持长期的抗肿瘤免疫记忆。肿瘤组织内树突状细胞的成熟比例提高至46.4%，同时M1型巨噬细胞比例显著上升，M1/M2比值从0.38提高至1.76，表明免疫抑制微环境被有效逆转。在肺转移模型中，2-pN@LNPs治疗使转移结节数量减少64.6%，肺组织病理切片显示转移灶明显缩小。在皮下肿瘤模型中，该疗法使肿瘤生长抑制率达到68.2%，肿瘤组织呈现核固缩、DNA断裂等典型凋亡与坏死特征，且治疗过程中小鼠体重及主要器官未出现明显毒性反应。

图5 （a）不同纳米制剂处理下免疫反应实验时间表示意图。（b）脾脏中CD4/CD8细胞的流式分析及（c）CD44/CD62L细胞（来自CD4+门）的分析。（d）肿瘤中CD80/CD86细胞及（e）CD86/CD206细胞的流式分析。（f）脾脏中CD4+ T细胞、（g）CD8+ T细胞和（h）记忆T细胞（CD44+/CD62L+）比例统计。（i）肿瘤中成熟DC细胞比例及（j）M1/M2巨噬细胞比例。（k）抗肿瘤免疫反应机制示意图。

图6 （a）体内4T1肺转移治疗实验时间表。（b）不同纳米制剂处理后肺组织的印度墨汁染色图像。（c）总肺结节数量统计（正面与背面）。（d）处理后肺组织H&E染色图像（比例尺：1 mm）及其放大图（比例尺：500 µm）。

图7 （a）不同纳米制剂治疗肿瘤的实验时间表。（b）肿瘤体积、（c）肿瘤重量、（d）肿瘤图像及（e）肿瘤生长曲线。（f）各组肿瘤样本的H&E染色、Ki67染色与TUNEL染色图像。比例尺：100 µm。（g）治疗期间小鼠体重变化。（h）治疗后主要组织H&E染色图像。比例尺：100 µm。

综上所述，该研究成功开发了一种具有“特洛伊木马”特性的线粒体靶向纳米平台，通过协同调控线粒体代谢与糖酵解，不仅有效诱导线粒体功能障碍与肿瘤细胞死亡，还成功激活了系统性的抗肿瘤免疫应答，为代谢干预与免疫治疗相结合的临床转化提供了新思路与实验依据。

来源：高分子科学前沿

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