同济大学/上海交通大学AM：可注射多功能水凝胶， 增强牙周骨缺损再生

牙周炎是一种由牙周病原体引起的炎症性疾病，临床表现为牙龈出血、牙周袋加深、牙齿松动甚至脱落，最终导致牙槽骨缺损。在侵袭性牙周炎中，独特的炎症微环境涉及细菌病原体招募和激活免疫细胞，释放活性氧，引发氧化失衡，诱导细胞凋亡，降低干细胞活性，抑制成骨细胞功能并促进破骨细胞生成。尽管已有多种生物材料被开发用于牙周骨再生，但现有策略往往难以同时应对免疫失调、氧化损伤和骨丢失等多重障碍，使得牙周骨组织的完整重建仍面临巨大挑战。

近日，同济大学范震主任医师、上海交通大学胥春主任医师合作提出了一种名为HTF@HA的可注射多功能水凝胶，其通过动态硼酸酯交联网络实现环境响应与时间控制释放生物活性因子。该水凝胶在酸性和氧化条件下更快降解，优先释放抗氧化和抗炎成分，促进巨噬细胞向M2表型极化并缓解炎症；在后续修复阶段，通过钙-磷酸相互作用介导浓缩生长因子和低剂量骨形态发生蛋白-2的持续释放，支持成骨分化和血管生成。体外实验显示，HTF@HA具有高生物相容性、抗氧化与抗炎能力，并能显著增强牙周膜干细胞成骨和内皮细胞血管生成。动物实验进一步证实，该水凝胶能促进新骨和血管形成，且在BMP-2剂量仅为50 μg/L时，其骨再生效果与高剂量500 μg/L相当。相关论文以“Environmental Response Temporal Release Injectable Hydrogel for Controlled Growth Factor Release to Enhance Inflammatory Periodontal Bone Defect Regeneration”为题，发表在

Advanced Materials

研究通过示意图1系统展示了HTF@HA水凝胶的组成与合成路径、CGF的制备与外源性BMP-2的加载过程，以及在大鼠牙周骨缺损模型中的局部注射应用。该水凝胶在牙周炎症微环境中表现出清除ROS、抑制M1巨噬细胞并促进M2极化的抗炎机制，其分子机制与调控NF-κB信号通路密切相关，同时通过细胞外基质相互作用和增强线粒体能量代谢促进干细胞成骨分化。图1进一步评估了水凝胶的物理化学性质，包括其宏观形态、可注射性、微观结构、元素分布、化学结构确认、降解行为、孔隙率、溶胀性能及流变特性，显示出优异的剪切稀化、自愈合与可控降解能力。

示意图1. （A）HB、HBT、HTF与HTF@HA水凝胶的组成与合成路径示意图；（B）CGF制备流程：包括志愿者采血、差速离心及外源性BMP-2的添加；（C）动物模型构建与HTF@HA水凝胶注射；（D）水凝胶系统在牙周微环境中的ROS清除功能；（E）水凝胶系统抗炎机制示意图：抑制M1巨噬细胞极化并促进M2极化；（F）水凝胶系统抗炎机制通路图：通过调控NF-κB通路实现抗炎作用；（G）水凝胶系统通过细胞外机制途径促进牙周膜细胞成骨分化；（H）水凝胶系统通过增强线粒体能量供应促进牙周膜细胞成骨分化。

图1 水凝胶的物理化学性质评估 （A）HB、HBT、HTF与HTF@HA水凝胶在玻璃瓶中的宏观形态；（B）HTF@HA水凝胶的可注射性示意图；（C）水凝胶微观结构的SEM图像（比例尺：20与100 μm）；（D,E）EDS测量的HTF@HA水凝胶元素组成；（F）质子核磁共振（1H NMR）谱图；（G）FTIR光谱揭示水凝胶样品间官能团变化；（H）水凝胶在PBS中的体外降解曲线；（I）水凝胶孔隙率测量；（J）HTF@HA水凝胶在10与20 μM过氧化氢浓度下的体外降解曲线；（K）HTF@HA水凝胶在pH 5.5与8.0条件下的体外降解曲线；（L）HTF@HA水凝胶在PBS、过氧化氢与酸性条件同时存在下的体外降解曲线；（M）三种水凝胶的溶胀行为；（N）水凝胶的流变性质。

图2集中展示了水凝胶的生物相容性与抗氧化性能。通过活/死细胞染色与CCK-8实验证实HTF@HA能有效缓解炎症环境下牙周膜干细胞的损伤并促进其增殖。电子顺磁共振与紫外-可见分光光度法显示该水凝胶对DPPH和羟基自由基具有高效清除能力，抗氧化性能随浓度增加而增强。图3则深入探讨了其抗炎机制与细胞迁移促进作用。水凝胶处理显著降低了M1型巨噬细胞标志物（IL-6、TNF-α、iNOS）的mRNA表达，并提升了M2型标志物（CD206、Arg-1、IL-10）的表达，免疫荧光结果进一步验证了其对M2极化的促进。此外，Transwell与划痕实验表明，HTF@HA能显著恢复炎症环境下牙周膜干细胞和内皮细胞的迁移能力。

图2 水凝胶的生物相容性与抗氧化性能评估 （A,B）水凝胶的流变性质；（C）应力-应变曲线；（D）水凝胶的最大压缩强度；（E）水凝胶的压缩模量；（F）HTF@HA水凝胶中BMP-2的体外释放曲线；（G）通过活/死细胞染色评估水凝胶的细胞相容性（比例尺：50 μm）；（H）使用CCK-8 assay在不同时间点测量的细胞活力；（I）DPPH自由基的ESR谱图；（J）HTF@HA水凝胶对DPPH自由基的清除效率；（K）DPPH自由基清除过程中的颜色变化；（L）•OH自由基的ESR谱图；（M）HTF@HA水凝胶对•OH自由基的清除效率；（N）•OH自由基清除过程中的颜色变化。

图3 水凝胶的抗炎特性及其对细胞迁移能力的影响 （A,B）使用DCFH-DA荧光探针检测的细胞内ROS水平定量分析及荧光强度（比例尺：20 μm）；（C–H）炎症相关基因（IL-6、TNF-、iNOS、CD206、Arg-1与IL-10）的mRNA表达水平；（I）水凝胶抗炎功能示意图；（J–M）IL-6与Arg-1表达的免疫荧光图像及定量分析（比例尺：20 μm）；（N,O）经水凝胶处理的PDLSCs的Transwell迁移图像及定量分析（比例尺：20 μm）；（P,Q）PDLSCs水平迁移的划痕实验图像及定量分析（比例尺：50 μm）。

图4聚焦于水凝胶在炎症条件下对成骨与血管生成的促进作用。ALP与ARS染色显示HTF@HA/CGF/BMP-2组能显著增强牙周膜干细胞的碱性磷酸酶活性与矿化结节形成。RT-qPCR分析发现成骨相关基因（ALP、OPN、OCN）与血管生成相关基因（vWF、VEGF、bFGF）表达均显著上调。免疫荧光与Western blot进一步证实该复合水凝胶能促进OPN与RUNX2蛋白表达，并增强HUVECs的血管网络形成。图5通过动物体内实验评估了水凝胶的治疗效果。Micro-CT三维重建与BV/TV定量分析显示，HTF@HA/CGF/BMP-2-50组在低剂量BMP-2下实现了与高剂量ACS/BMP-2-500组相当的骨再生效果。H&E与Masson染色进一步证实该组新骨结构致密、胶原沉积丰富。

图4 水凝胶对细胞迁移的影响及其对成骨与血管生成的促进作用 （A,B）HUVECs的Transwell迁移图像及定量分析（比例尺：20 μm）；（C,D）HUVECs水平迁移的划痕实验图像及定量分析（比例尺：50 μm）；（E）成骨诱导后PDLSCs的ALP染色（比例尺：20 μm）；（F）成骨诱导后PDLSCs的ARS染色（比例尺：50 μm）；（G–I）水凝胶刺激的PDLSCs中成骨相关基因ALP、OPN与OCN的表达水平；（J,K）经水凝胶处理的HUVECs血管网络形成的免疫荧光图像及定量分析（比例尺：50 μm）；（L–N）水凝胶刺激的HUVECs中血管生成相关基因vWF、VEGF与bFGF的表达水平；（O,P）水凝胶刺激的PDLSCs在成骨诱导期间OPN蛋白表达的免疫荧光图像及定量分析（比例尺：20 μm）；（Q）水凝胶刺激的PDLSCs在成骨诱导期间OPN与RUNX2蛋白表达的Western blot分析。

图5 动物实验的体内评估结果 （A）动物模型构建、水凝胶给药与样本采集过程示意图；（B）各组上颌骨的三维micro-CT重建图像（比例尺：1 mm）；（C）大鼠上颌骨缺损的感兴趣区域（ROI）；（D）micro-CT数据中BV/TV的定量分析；（E）上颌骨的H&E染色图像（比例尺：500, 100 μm）；（F）上颌骨的Masson三色染色图像（比例尺：500, 100 μm）。

图6通过免疫荧光染色揭示了水凝胶在体内对免疫微环境与再生过程的调控。CD206表达上调与iNOS表达下调表明水凝胶促进了M2巨噬细胞极化并抑制了M1极化。OPN与CD31共定位显示其同步增强了成骨与血管生成过程。图7与图8通过转录组测序与验证实验深入阐明了其分子机制。在RAW 264.7细胞中，水凝胶通过抑制NF-κB p65磷酸化调控TLR/NF-κB等炎症通路；在牙周膜干细胞中，则通过恢复氧化磷酸化通路功能、提升ATP合成与ATP5A蛋白表达，增强线粒体能量代谢，从而支持成骨分化。

图6 动物实验的免疫荧光染色结果 （A,B）CD206的免疫荧光图像及定量分析；（C,D）iNOS的免疫荧光图像及定量分析；（E–G）OPN与CD31的免疫荧光共染色图像及其定量分析，用于评估成骨与血管生成。

图7 RAW 264.7细胞的测序分析与验证结果 （A）RAW 264.7细胞测序样本的Pearson相关性热图；（B）RAW 264.7细胞中差异表达基因（DEGs）的火山图；（C）RAW 264.7细胞中DEGs的层次聚类热图；（D）RAW 264.7细胞中DEGs的GO富集分析；（E）RAW 264.7细胞中DEGs的KEGG通路富集分析；（F）RAW 264.7细胞中NF-B信号通路示意图；（G）磷酸化NF-B p65表达水平的Western blot结果。

图8 PDLSCs的测序分析与验证结果 （A）PDLSCs测序样本的Pearson相关性热图；（B）PDLSCs中差异表达基因（DEGs）的火山图；（C）PDLSCs中DEGs的层次聚类热图；（D）PDLSCs中DEGs的GO富集分析；（E）PDLSCs中DEGs的KEGG通路富集分析；（F）PDLSCs中氧化磷酸化通路示意图；（G）PDLSCs中MitoTracker Deep Red FM染色结果（比例尺：20 μm）；（H）ATP活性测量结果比较；（I）ATP5A蛋白表达的Western blot（WB）结果。

综上所述，HTF@HA水凝胶系统通过“顺序释放‑多功能集成”策略，实现了在炎症微环境中智能调控免疫反应与持续促进组织再生的双重目标。该研究不仅为炎症相关牙周骨缺损的精准治疗提供了新材料平台，也为未来针对复杂疾病微环境的组织再生材料开发奠定了理论与技术基础。

来源：高分子科学前沿

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