Nat Cell Biol | RNA结合蛋白在细胞分化过程中介导染色质拓扑结构的成熟

撰文 |章台柳

哺乳动物基因组中，启动子-增强子通常以拓扑关联结构域（TADs）的形式折叠形成强自我相互作用区域。TAD边界之间常发生相互作用，形成染色质架构环。多项证据表明，通过调控启动子-增强子的对话，TADs和架构环构成基因组组织的功能单元。

CCCTC结合因子（CTCF）是一种广泛表达的11锌指DNA结合蛋白，其绝缘子功能可保护启动子免受异常增强子活性的影响。通过阻滞cohesin复合体（包含染色体结构维持蛋白SMC1、SMC3、RAD21及辅助蛋白）的易位，CTCF形成TAD边界和架构环锚点。构成TAD边界的CTCF结合位点均朝向TAD中心方向。同样，架构环绝大多数连接两个反向平行的CTCF结合 motif。

CTCF对正常发育和组织稳态非常重要，敲除CTCF会导致小鼠胚胎发育停滞，而单等位基因缺失会提高癌症易感性。人类CTCF杂合性功能缺失突变可导致智力障碍。此外，CTCF结合位点的删除或倒置会削弱TAD边界和架构环，引起启动子-增强子互作异常、基因错误表达、发育缺陷或癌症。与此一致的是，CTCF结合的环锚点常与疾病相关遗传变异（包括神经精神疾病）重叠。因此，CTCF的架构功能是细胞分化、胚胎发育、器官稳态及高级脑功能的基础。

尽管TAD边界和架构环的基因组坐标在不同细胞类型和进化过程中高度保守，但其强度在发育过程中受到调控并影响基因表达。TADs和环结构在合子基因组激活时开始形成，随着全能性丧失（囊胚细胞向多能干细胞状态转变），其强度逐渐增强。当细胞退出多能性状态、定向分化为神经谱系并最终成熟时，TAD和环结构进一步发展。重编程可逆转此效应。然而，驱动架构环和TAD边界整体强化的机制及其在早期胚胎发育中的作用仍属未知。

近日，来自波兰科学院的Aleksandra Pękowska团队在Nature Cell Biology杂志上发表文章RNA-binding proteins mediate the maturation of chromatin topology during differentiation，发现在胚胎干细胞（ES）向神经干细胞（NS）分化过程中，CTCF与RNA结合蛋白（RBP）的相互作用广泛增强。虽然RBP在ES细胞中非必需，但在NS细胞中能强化CTCF锚定的染色质拓扑结构。同时鉴定出长链非编码RNA Pantr1作为CTCF-RBP相互作用的关键媒介，通过促进染色质成熟驱动分化进程。通过急性CTCF降解实验发现，CTCF通过其绝缘子功能在NS细胞中维持神经元基因沉默，在发育过程中充当阻止基因过早激活的屏障。本研究揭示了一个驱动发育相关染色质结构固化的核心机制，并阐明该过程对分化过程中基因表达调控的贡献。

染色质构象分析显示，在退出多能性状态时CTCF锚定的架构环和TAD边界强度显著增强。为了探究其中的分子机制，研究人员首先比较了胚胎干细胞（ES）和神经干细胞（NS）中CTCF的分布模式。NS中CTCF蛋白水平低于ES，但两者染色质结合的CTCF量相当，表明CTCF与DNA的结合在两种细胞类型中相似。但通过近超分辨共聚焦（AiryScan）和超分辨（STED）成像技术发现，NS细胞中CTCF簇集现象比ES细胞更显著。即多能性的丧失伴随着CTCF核内分布的整体性改变——神经谱系定型细胞表现出更大的CTCF核质簇集现象。随后，研究人员使用染色质免疫沉淀-染色质相关蛋白选择性分离技术来分析ES与NS细胞中与CTCF结合的染色质相关蛋白。通过定量比较两种细胞中CTCF结合染色质区域的蛋白丰度，发现序列特异性转录因子（包括Dpp4、Zbtb4b、Sall4和Fiz1等）在ES细胞CTCF相互作用组中更丰富（Ybx1是NS细胞中唯一与CTCF相互作用增强的序列特异性转录因子）。PRC2在ES细胞中形成多梳体（PcGs），并在神经分化过程中解组装。与这一现象一致，ChIP-SICAP显示NS细胞中CTCF与PRC2蛋白的相互作用较ES细胞显著减少。值得注意的是，NS细胞中与CTCF相互作用增强的靶标显著富集于RNA结合蛋白（RBPs），包括DEAD-box RNA解旋酶Ddx5、肉瘤融合蛋白（Fus）与非POU结构域八聚体结合蛋白（Nono）。即在ES向NS分化过程中，CTCF-RBP相互作用存在全局性增强。CTCF-RBP-RNA相互作用可影响染色质三维结构。利用CRISPR-Cas9技术敲除Ddx5或Fus，对ES细胞中CTCF分布无显著影响，但导致NS细胞中CTCF簇集现象显著减少。NS细胞中，Ddx5通过解旋G4四链体促进CTCF在复杂序列环境的结合，进而通过调控CTCF结合维持染色质环结构。

清除细胞RNA发现，CTCF-RBP相互作用完全依赖于RNA的存在，其中长链非编码RNA——Pantr1不仅在ES向NS转变过程中被强烈诱导，且在NS细胞中持续高表达。Pantr1与CTCF不仅存在共定位，且存在紧密相互作用。敲低Pantr1表达，不影响CTCF蛋白水平，但导致CTCF-Ddx5相互作用显著减少，CTCF-Fus相互作用减弱。同时发现，Pantr1增强NS细胞染色质环和TAD边界强度。

研究人员探究了CTCF缺失对基因调控的影响。急性诱导CTCF缺失对染色质开放性和H3K27ac（活跃启动子和增强子的标志物）均未产生全局性显著影响，故其对转录的影响主要源于CTCF架构功能的丧失。ES细胞中，CTCF缺失导致775个基因位点表达改变；而在NS细胞中，556个基因表达改变。值得注意的是，ES细胞中下调基因多于上调基因，而NS中基因激活数量显著多于抑制，这种基因激活反映了基因异常暴露于增强子。这说明，神经诱导后，CTCF绝缘功能增强。那么这种绝缘功能增强的意义是什么？对ES和NS中CTCF调控基因进行探究，发现NS细胞中CTCF缺失导致细胞分化相关基因表达增强，而下调少突胶质细胞发育相关基因。CTCF参与调控神经系统发育相关的细胞类型特异性基因。研究人员最终提出一个描述多能性退出后染色质结构固化机制与功能贡献的模型：ES细胞分化导致Pantr1（CTCF的非编码RNA伴侣分子）转录上调，该RNA介导CTCF与RNA结合蛋白（RBPs）的相互作用。CTCF-RBP-RNA相互作用促进谱系定型细胞中CTCF的簇集、DNA结合及染色质环稳定性。由此在NS细胞中形成的强化绝缘子活性可阻止神经元基因的异常表达，从而在发育过程中参与细胞命运调控。

总的来说，这项研究揭示了胚胎干细胞分化过程中，CTCF、RBPs和非编码RNA通过协同作用强化染色质架构，从而指导分化过程中的细胞命运决定。

https://www.nature.com/articles/s41556-025-01735-5

制版人： 十一

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