《食品科学》：四川农业大学刘书亮教授等：C端替换提高酚酸脱羧酶BJ6PAD的底物催化活性及其分子动力学模拟

酚酸脱羧酶是一种可以催化酚酸发生非氧化脱羧反应生成相应4-乙烯基类衍生物的酶。这些4-乙烯基衍生物具有独特的挥发性香气和极低的感知阈值，被广泛应用于果酒、啤酒及一些发酵食品和饮料的香气调节中。利用酚酸脱羧酶生物合成的4-乙烯基酚类物质属于天然物质，且具有反应温和、纯度高、转化率高等优点，拥有巨大的发展潜力。目前，在利用天然酶转化酚酸获得相应产物的过程中，酶活力较低、稳定性较差及不易纯化等问题凸显。随着基因及蛋白工程的发展，基因克隆及构建高效表达系统是获得大量目标酶的成熟途径。分子改造也是快速获取优质酶资源的重要手段之一。

四川农业大学食品学院的陈阴竹、李琴*、刘书亮*等研究从枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis ） J6 中克隆酚酸脱羧酶 BJ6PAD 基因，使其在 E. coli BL21(DE3) 中表达，获得高表达量且酶活力较高的重组酶；同时设计特异性引物将变异率较高且对底物特异性有影响的 C 端进行替换，构建突变体 BJ6PAD-C1 和 BJ6PAD-C2 ，对其酶学性质进行研究和比较，并基于分子动力学模拟对突变结果进行更深入的分析和解释，对后续探究 BJ6PAD 的 C 端与酶学性质的关联具有一定的理论指导意义。

1 C端替换突变酶的构建

近年来，已有学者对不同生物体的酚酸脱羧酶晶体结构进行了报道，对其氨基酸序列进行比对后发现，酚酸脱羧酶家族序列具有高度保守性，结构之间的差异主要集中在C端及N端的无规卷曲中。其中，酚酸脱羧酶的C端区域序列与酚酸脱羧酶的催化性质具有密切联系。虽然BJ6PAD与FADase的氨基酸序列具有50%以上的一致性，但它们在不同酚酸的代谢中表现出不同的活性。本研究通过交换其不同长度的C端部分，构建C端替换突变体，以阐明决定这些差异的结构域。本研究的分子改造思路是将催化性质不同的2 种酚酸脱羧酶的C端序列进行替换，将B. subtilis J6中获得的酚酸脱羧酶（BJ6PAD）的C端序列替换为Enterobacter sp. Px6-4来源的酚酸脱羧酶（FADase）的C末端，研究C端替换对原酚酸脱羧酶底物特异性及稳定性的影响，以更好地研究酚酸脱羧酶结构与功能之间的关系。其中，FADase仅对阿魏酸有活性且酶活力较高，且在较广的温度和pH值范围内表现出稳定性。根据拟定的突变策略获得2 段突变体序列BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2。以pET-28a(+)-BJ6PAD质粒为克隆模板，采用特定引物进行PCR扩增后获得C端替换酚酸脱羧酶基因（图1A）。扩增产物的大小在500 bp左右，与C端替换基因相匹配。序列比对结果如图1B所示。

2 C端替换突变酶的表达与纯化

如图2所示，对BJ6PAD及突变酶的酶液进行SDSPAGE测定，可观察到C端替换突变菌均成功被诱导表达；且突变酶与未经突变的原酚酸脱羧酶一致，在22 kDa左右有1 条明显的条带。粗蛋白经镍柱亲和纯化后，得到分子质量约为22 kDa的单一条带。

3 酶学性质分析

3.1 pH值及温度对酶活力的影响结果

如图3A所示，C端替换对酶的最适pH值的影响较小，BJ6PAD和BJ6PAD-C2的最适反应pH值为6.0，BJ6PAD-C1的最适反应pH值变为6.5。在较低的pH值条件下（pH 4.0～5.0），经过替换后得到的突变酶与野生酶相比，酶活力明显降低。在pH 5.0～8.0时，2 种突变酶与野生酶活力保持在最高活力的50%以上。与原酶相比，BJ6PAD-C1减少了2 个带正电荷的氨基酸和1 个带负电的氨基酸，BJ6PAD-C2减少了1 个带负电的氨基酸，蛋白表面电荷的改变可能会使酶的最适条件发生变化。且BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2带电荷氨基酸数量也不同，导致2 种突变酶的反应条件也有区别。将3 种酶在不同pH值下放置1 h以测定其pH值稳定性，结果如图3B所示，BJ6PAD-C2在整个pH值范围内几乎完全失活；BJ6PAD-C1在pH 7～8范围内较稳定，残余酶活力在50%以上，在其他pH值范围内酶活力较低。如图3C所示，BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2的最适反应温度由BJ6PAD的50 ℃降低到40 ℃。但总体上野生酶和突变酶活力受反应温度影响的变化趋势保持较高的一致性，在35～55 ℃范围内，酶活力均保持在最高酶活力的80%以上；在55～70 ℃条件下，3 种酶的酶活力均呈下降趋势，但其残余酶活力均在50%以上。由图3D可知，经过C端替换得到的突变酶热稳定性有一定的下降，在40 ℃下放置1 h后，两者完全失活。

3.2 金属离子和化学试剂对酶活力的影响结果

不同的金属离子及化学试剂对酶活力的影响区别较大。通过对该指标的测定，使操作者对反应体系中的成分添加更加注意，从而在一定程度上增强酶活力或避免酶活力丧失，为实际生产提供参考。如图4所示，K+、Ca2+、Mg2+对3 种酶的酶活力具有一定的促进作用，其中，Ca2+的促进作用最明显。SDS对原酶及突变酶BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2均具有极强的抑制作用，在5 mmol/L的浓度下能使相对酶活力降低至29.61%甚至失活。

3.3 底物特异性和酶促动力学参数测定结果

如表2所示，3 种酶对对香豆酸的底物特异性远高于其他3 种酚酸，且几乎不催化芥子酸，与目前已表征的酚酸脱羧酶的底物催化规律几乎一致。此外，C端替换得到的突变体BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2对4种底物的催化活性与原酶相比有明显改变。其中，BJ6PAD-C1对阿魏酸和芥子酸的催化活性分别下降11.82%和24.99%，对对香豆酸和咖啡酸的催化活性分别提高9.11%和20.34%；BJ6PAD-C2对阿魏酸的催化活性下降7.54%，对对香豆酸、咖啡酸和芥子酸的催化活性分别提高13.14%、29.97%和14.28%。如表3所示，与BJ6PAD相比，BJ6PAD-C1对阿魏酸、咖啡酸和芥子酸的Km降低，kcat/Km分别增加4%、24%、145%，而对对香豆酸的Km从6.86 mmol/L增加至8.14 mmol/L；BJ6PAD-C2对4 种底物的亲和力和催化效率均明显提高，尤其是对芥子酸，其对4 种底物的Km分别降低至6.75、3.83、3.09、1.53 mmol/L，kcat/Km分别增加15%、7%、37%、114%。这说明C端氨基酸序列的改变会影响底物特异性和催化作用，与先前报道的结果一致。

4 同源建模、分子对接及分子动力学模拟计算结果

4.1 酚酸脱羧酶同源建模及结构评价

通过在线预测平台SWISS-MODEL对野生型酚酸脱羧酶BJ6PAD和突变型酚酸脱羧酶BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2进行同源建模，选取序列同源性最高且晶体结构已被解析的B. pumilus UI-670来源的酚酸脱羧酶作为模板（PDB：3NAD），结果如图5所示。拉氏分析图被用于描述蛋白质结构中氨基酸残基二面角φ和Ψ是否处于合理区域，可用于表征同源建模结果的合理性。结果表明，BJ6PAD中90.8%的氨基酸位于完全允许区域，9.2%的氨基酸位于允许区域；BJ6PAD-C1中88.3%的氨基酸位于完全允许区域，11.3%的氨基酸位于允许区域；BJ6PAD-C2中88.8%的氨基酸位于完全允许区域，10.9%的氨基酸位于允许区域，总和超过99%，表明本研究所得的酚酸脱羧酶结构合理。

4.2 分子对接结果分析

将对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和芥子酸作为配体，BJ6PAD和2 个突变体BJ6PAD-C1、BJ6PAD-C2作为受体，利用AutoDock Vina软件将经过预处理的上述配体和受体模型对接，再通过能量最小化寻找最合理的构象，这样可以更直观地推测关键氨基酸。如图6所示，3 种酶与底物酚酸之间的相互作用力主要是氢键和范德华力，此外还有π-π堆积作用、π-烷基相互作用和C—H键。以对香豆酸和咖啡酸为底物时，与BJ6PAD相比，C端替换突变酶BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2可与底物之间形成C—H键，且疏水相互作用增强，使底物结合口袋的整体疏水相互作用增强，可以更好地结合和稳定疏水性的底物，导致酶的催化性能明显提高；突变体与底物阿魏酸之间没有形成C—H键，这可能是其催化性能更低的主要原因；与原酶相比，突变体BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2对芥子酸的活性下降，这可能是由于二者只存在与底物之间的疏水相互作用，而酶与底物之间的氢键作用力降低甚至消失。通过分子对接图（图6）及酚酸脱羧酶序列比对图（图1B）可发现，酚酸脱羧酶与底物酚酸的结合区域为β-核心桶与α-螺旋底部之间，这与之前的研究一致。尽管C末端并不是组成底物结合腔的分子元件，但突变后发生作用的氨基酸残基有所改变，即C端序列的改变会对底物结合位点有一定的影响。

4.3 分子动力学模拟计算

对上述模建的BJ6PAD及其C端替换突变体BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2与4 种底物对接得到的复合物分别进行分子动力学模拟研究，测定反应体系的均方根偏差（RMSD）、均方根涨落（RMSF）、回转半径（Rg）、溶剂可及表面积（SASA）、氢键数量及结合自由能等指标，进一步分析不同配体结合对蛋白质结构稳定性影响的差异及C端替换影响底物特异性的原因。

4.3.1NDMA风险评估结果比较

RMSD为一个特定原子相对于参考结构的坐标偏差，常被用来评估仿真系统是否达到稳定。当RMSD趋于恒定时可以认为该蛋白构象稳定，相对越低的RMSD对应的蛋白质结构越稳定。如图7所示，在模拟过程中，以对香豆酸、阿魏酸和咖啡酸为底物时，复合体系的相对运动更稳定，二者的结合可能更加契合，表现为较高的催化活性。而以芥子酸为配体形成的复合物RMSD波动性较大，不利于对底物进行识别，酶催化芥子酸的能力可能较弱，这一结果与上述底物特异性测定结果一致。另外，在以咖啡酸为配体时形成的复合物RMSD可在较短时间内达到平衡，且保持在较低的范围，说明酶可以有效识别该配体，可能表现为较高的亲和力。相较于原酶，突变体对4 种底物的RMSD更波动，尤其是芥子酸；但4 个反应体系在模拟时间（50 ns）内RMSD仍可达到稳定，且终值都停留在0.4 nm以下，说明C端替换后，残基的变化使酚酸脱羧酶结构稳定性变差，但突变酶与4 种底物的结合仍比较稳定。此外，对2 个突变体模拟得到的RMSD进行比较发现，替换更宽范围的C端得到的突变体BJ6PAD-C2的RMSD终值更低，其与底物的结合稳定性稍高。

4.3.2不同底物对酶RMSF的影响

RMSF代表每个原子相对于其平均位置的涨落，被用于衡量在动力学模拟过程中原子运动的自由程度，从而反映蛋白质区域运动的灵活性。由于蛋白质中不同区域具有不同的生物功能，通过观察残余物的RMSF变化，可以获取不同反应体系下蛋白质的变性程度。如图8所示，C端区域的RMSF在不同体系中表现出明显的差异性，且突变体与不同配体结合后C端区域的RMSF与原酶相比明显较大，说明该区域的氨基酸残基运动自由度高。结合RMSD波动变化，不难推断出在整个构象演化过程中，C端序列的构象变化可能导致总RMSD差异。该区域位于酚酸脱羧酶活性区域附近，对酶的催化活性有重要影响，推测突变体C端区域的高运动自由度会使底物酚酸更易进入酶的活性口袋区域，从而促进酶对酚酸的催化水解作用。与此同时，C端的多数氨基酸残基柔性运动更显著，可能导致内部分子间丢失部分作用力，造成蛋白质碳骨架及整体构象的不稳定。此外，突变体在135～145残基的RMSF变化也较为明显，且该区域位于底物结合袋位置，该区域的柔性改变可能会影响酶的折叠，进而影响酶与底物分子的识别与结合。

4.3.3不同底物对酶Rg的影响

Rg被用来证明模拟过程中蛋白质结构的紧密度，代表特定时间间隔内所有原子质心与其末端之间的距离。如果蛋白质的折叠很稳定，其Rg将保持一个相对稳定的值，Rg变化越大表明蛋白结构变化越大。如图9所示，突变后酶在不同底物条件下，其Rg与原酶相比有一定幅度的波动，C端替换可能导致该蛋白内部结构发生改变，导致其整体空间结构发生改变。

4.3.4不同底物对酶SASA的影响

SASA是通过范德华力与溶剂分子相互作用的溶质面积，蛋白质的SASA随蛋白质紧密度的增加而降低，因此SASA可以预测蛋白质结构的变化。如图10所示，原酶与咖啡酸和对香豆酸2 种复合物的SASA明显大于BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2与这2 种底物形成的复合体的SASA；突变体对阿魏酸和芥子酸的SASA比原酶略低。说明突变酶比原酶疏水性更强，这与前文分子对接的结果一致，即突变后酶与配体之间形成了新的疏水相互作用。降低的SASA代表酚酸脱羧酶内部活性部位的疏水性增加，有利于底物的结合，C端替换能促进底物更好地结合到酚酸脱羧酶活性口袋上。

4.3.5不同底物对酶氢键的影响

进一步分析BJ6PAD和2 个突变体与配体之间的氢键关系，氢键对于维持蛋白质的稳定具有重要作用。如图11所示，本研究中的酶与小分子均存在氢键相互作用，以不同底物为配体及以突变前/后的酶进行模拟时，形成的氢键数量有明显差异。在对香豆酸复合组中，突变体的氢键数量与原酶相差不大。以咖啡酸为底物时，BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2的氢键数量由原酶的0.56分别提高到0.79和0.63；BJ6PAD-C2与芥子酸之间的氢键数量由原酶的0.58提高到0.84，C端替换可能会提高酶与底物的亲和力，从而提高对底物的催化效率。以阿魏酸为配体时，BJ6PAD、BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2三者形成的氢键数量分别为0.58、0.32和0.25，突变后氢键数量明显降低，这可能导致酶与底物阿魏酸的结合稳定性降低。

4.3.6不同底物对酶结合自由能的影响

采用分子力学/泊松-波尔兹曼表面积（MM/PBSA）法对分子动力学模拟轨迹进行结合自由能计算。在MM/PBSA方法应用中，将总的结合能分解为4 个独立部分（静电作用、范德华力、极性溶剂化相互作用和非极性溶剂化相互作用）。其中，范德华力、静电作用和非极性溶剂化相互作用可以促进酶和底物结合，极性溶剂化相互作用对其具有抑制作用，范德华力、静电作用和非极性溶剂化相互作用的总自由能可以抵消极性溶剂化自由能的不利影响，从而维持这些酶与底物的稳定结合。

由表4可知，所有对接模型的总结合自由能均小于0，说明无论是原酶还是突变型酚酸脱羧酶都可以与底物酚酸自发地进行相互作用。对不同受体结合能进行比较后发现，与先前发现的不同来源酚酸脱羧酶的底物催化特性一致，其可使对香豆酸脱羧且具有较高的活性。与BJ6PAD相比，BJ6PAD-C1对对香豆酸和芥子酸的总结合自由能均降低，说明该突变有利于增强酶与这2 种配体的结合。BJ6PAD-C2对对香豆酸和咖啡酸的结合稳定性有明显的提高，有利于提高酶对对香豆酸和咖啡酸的催化效率；而对阿魏酸和芥子酸的总结合自由能分别提高至-8.501、-6.718 kJ/mol，猜测这2 种底物不能稳定结合到酚酸脱羧酶底物的结合口袋中。该模拟结果与实验结果具有较高的相似性。印证了酚酸脱羧酶的C端结构与酶的催化特性，特别是底物特异性有关。

活性中心某些氨基酸组成与酚酸脱羧酶活性紧密相关，目前对酚酸脱羧酶的突变研究也主要集中在这部分。通过对酚酸脱羧酶催化机理的研究发现，以Enterobacter sp. Px6-4酚酸脱羧酶为例，23位天冬氨酸（Asn）通过其酰胺基获得极性，可以与水分子形成氢键，确保在疏水口袋中存在水分子，Tyr27和Glu134通过氢键分别连接底物的羧基和羟基，当将其突变为其他氨基酸时，酶活力降低甚至完全失活；Rodríguez等也对L. plantarum LpPDC进行了突变研究，发现当这几种氨基酸突变后，会影响底物结合袋的开合，酶活力也会受到相应影响。但C端和N端对酶性质带来的影响也不可忽视。目前已有学者对酚酸脱羧酶的C端进行截断或替换，证实了其对催化功能具有重要意义。Barthelmebs等将来自4 种细菌的酚酸脱羧酶C端进行相互替换，发现突变酶对3 种底物酚酸的催化活性与原始的酚酸脱羧酶有较大差异，通过C端替换可能会提高酶对多种底物的酶活力。嵌合B. pumilus表达的酚酸脱羧酶N端序列和L. plantarum酚酸脱羧酶C端序列得到的突变体，对阿魏酸的酶活力比对对香豆酸的酶活力高10 倍。本研究将仅对阿魏酸有活性且酶活性较高的FADase的C端序列替换到BJ6PAD的C端，探讨蛋白质C端氨基酸序列的变化对酚酸脱羧酶活性的影响。所构建的2 个C端替换突变体BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2对对香豆酸和咖啡酸的催化活性有明显提高；且对大部分底物的亲和力和催化效率有不同程度的提高，尤其是对芥子酸，原酶对芥子酸的Km和kcat/Km分别为4.03 mmol/L和2.71 L/（mmol•s），而BJ6PAD-C1和BJ6PAD-C2对芥子酸的Km分别为0.77、1.53 mmol/L，kcat/Km分别提高至6.65、5.80 L/（mmol•s）；但突变后酚酸脱羧酶对阿魏酸的酶活力有一定的下降。不同来源的酚酸脱羧酶的特性已有多篇报道，大部分酚酸脱羧酶更适于在酸性条件（pH 5～6）及常温条件（20～30 ℃）下反应，难以满足工业应用需求。相较而言，本研究中的B. subtilis J6及其突变酶可以在较广的温度和pH值范围内保持较高的酶活力，在pH 5.5～7.0、温度35～55 ℃范围内，酶活力均保持在最高酶活力的80%以上，具有较好的发展前景。但突变后酶的稳定性较原酶差，根据序列比对及同源建模可知，2种酚酸脱羧酶C端的分子结构存在差异，FADase的C端区域为无规卷曲，而BJ6PAD含有α-螺旋，当将BJ6PAD的C末端进行替换时，会破坏其α-螺旋结构，从而影响结构的稳定性。分子对接结果显示，将酚酸脱羧酶的C端进行替换后，与底物相互作用的氨基酸也发生相应改变，猜测氨基酸残基间的相互作用会影响蛋白质的空间结构，从而导致底物结合区域的变化。此外，突变体对对香豆酸和咖啡酸之间产生疏水相互作用，可能导致酶催化性能提升。而对于咖啡酸和芥子酸的催化性能有不同程度的降低，原因可能是其与底物之间的氢键、疏水相互作用和C—H键等分子间相互作用力减少。通过分子动力学模拟计算比较了BJ6PAD及其C端替换突变酶催化4 种底物（对香豆酸、阿魏酸、咖啡酸和芥子酸）的能力。从蛋白质构象变化方面来看，C端替换会使酶结构发生改变，尽管C端替换导致酶与配体的结合稳定性较原酶有一定的降低，但突变体与配体仍可以稳定结合。测定模拟过程中的RMSF发现，该突变会使C端的RSMF波动性更强，即该部位的柔性增加，这可能是导致RMSD数值波动的原因。并分析了C端替换影响酚酸脱羧酶催化底物活力的原因：突变使蛋白质的入口通道变宽，使配体更易进入底物结合袋发生反应；另一方面，C端替换导致酶结构发生改变，可能会造成底物“脱靶”，从而降低其催化活性。此外，SASA结果表明，突变还会增强酶与对香豆酸和咖啡酸内部活性部位的疏水性，从而促进其催化作用。能量差异方面，BJ6PAD-C1增加了与咖啡酸形成的氢键数量；尽管与对香豆酸和阿魏酸的氢键数量略低，但其具有更低的结合自由能，使酶活性部位可以更高效地识别底物。BJ6PAD-C2与对香豆酸、咖啡酸和芥子酸形成的氢键数量更多，结合自由能更低，说明BJ6PAD-C2对底物的结合能力有明显的提升。综上所述，本研究构建的突变体与底物之间的结合稳定性与原酶相似，但对大部分底物的疏水相互作用、氢键数量及总能量优于原酶，这可能是导致其对大部分底物结合及催化能力更佳的原因。

结 论

本研究通过对酚酸脱羧酶底物特异性有影响的C端序列进行替换，获得了底物催化特性不同的突变酶，突变酶对部分底物的催化活性、亲和力和催化效率有一定的提升，尤其是咖啡酸和芥子酸。并利用分子对接和分子动力学模拟计算，对突变结果进行了更深入的分析。分析分子对接结果发现，C端替换改变了酶的空间结构及氨基酸残基与底物的相互作用；分子动力学模拟结果显示，C端突变会使入口通道变宽，底物能够很容易地进入蛋白质的活性口袋，同时增强了与部分底物内部活性部位的疏水性，进而使催化位点与底物之间的质子传递更加高效，促进酚酸脱羧酶催化底物水解，这些变化的共同作用影响了酶的催化性能。总体而言，虽然构建的突变体在稳定性方面略低于原酶，但对大多数底物的结合和催化能力更佳，具有一定的研究意义，为后续酚酸脱羧酶的精确改性提供了研究思路。

本文《C 端替换提高酚酸脱羧酶BJ6PAD的底物催化活性及其分子动力学模拟》来源于《食品科学》2025年46卷第10期95-107页，作者： 陈阴竹，李 琴*，胡凯弟，李建龙，赵 宁，苟良逊，刘书亮* 。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20240828-215. http://www.spkx.net.cn 点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

实习编辑：申婧婧；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

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