韩国团队开发CRISPRa/i系统，双模式调控基因提升紫色素产量

CRISPR 技术的发展极大地推动了合成生物学和代谢工程的进步，其中以失活 Cas9 蛋白为核心的转录调控工具发挥了重要作用。CRISPRi 在细菌中已经被广泛应用并表现出稳定的基因抑制效果，但高效的 CRISPRa 系统在细菌中仍然稀缺。由于缺乏一个能够在同一框架下兼具激活与抑制功能的通用工具，研究人员在重编程细菌复杂代谢网络时一直面临显著的局限。

近日，韩国科学技术院与韩国化学技术研究院的研究团队在 Nucleic Acids Research 发表了最新成果“Dual-mode CRISPRa/i for genome-scale metabolic rewiring in Escherichia coli”，报道了一种基于 dxCas9 与大肠杆菌 CRP 融合的双模式 CRISPRa/i 系统。这一系统能够在基因组范围内实现激活与抑制的并行操作，并在代谢工程中展示了显著应用价值。研究团队通过该系统在大肠杆菌中实现了紫色素产量的显著提升，验证了其作为代谢网络调控平台的潜力。

该系统的设计建立在两方面的创新之上。研究人员选择了经过进化改造的 dxCas9，这一 Cas9 变体具备更广泛的 PAM 序列识别能力，不仅能结合传统的 NGG 位点，还能识别 NG、GAA 和 GAT 等多种序列。这一特性扩大了可靶向的基因组范围，使其更适合用于大规模基因筛选和系统性代谢调控。

并且，研究团队利用了大肠杆菌的内源性全局转录因子 CRP 作为激活效应域。CRP 能够与 RNA 聚合酶相互作用并促进转录启动，因此是天然的转录激活因子。在该研究中，研究人员去除了 CRP 的 DNA 结合区域，仅保留其激活结构域，并将其与 dxCas9 通过柔性连接肽融合，从而形成具备双功能的效应器模块。通过对连接肽长度和 CRP 不同激活区域组合的系统优化，最终确定 dxCas9 与删除了DNA结合结构域的CRP变体（CRPΔAR123） 通过 10 个氨基酸连接肽融合的构型为最佳方案，能够使目标基因的转录水平提高近 5 倍。

图 | 双模式 CRISPRa/i 系统原理示意图

为了验证系统的功能，研究人员首先在报告基因层面进行测试。结果显示，该系统在单基因激活和抑制方面均表现出显著效果，激活效率最高可达 4.9 倍，抑制效率则达到 83%。更重要的是，该工具能够在同一细胞中同时实现基因的激活和抑制。在双荧光报告实验中，研究团队构建了分别由弱启动子驱动的 GFP 和由强启动子驱动的 mCherry。当同时引入用于激活 GFP 的 gRNA 和用于抑制 mCherry 的 gRNA 时，系统使 GFP 表达水平提高了 8.6 倍，同时使 mCherry 表达水平下降了 90%。这充分证明了该系统不仅可以在不同条件下切换功能，而且能够在同一时间并行调控多个基因。

在进一步的应用研究中，研究人员将该系统用于代谢工程中紫色素的产量提升。紫色素是一种来源于紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）的天然产物，具有抗肿瘤等生物活性，因而在医药和化妆品领域具有潜在价值。为了在大肠杆菌中优化其合成途径，研究团队构建了覆盖全基因组的 gRNA 文库，其中包含约 2.5 万个靶点，涵盖激活和抑制的不同组合。他们将文库转入紫色素生产菌株，通过观察菌落颜色深浅来筛选潜在的高产突变株，并对其产量进行定量分析。

筛选结果表明，激活 rluC 基因和抑制 ftsA 基因分别能够带来显著的增产效果。激活 rluC 使紫色素产量提高约 2.9 倍。该基因编码 23S rRNA 假尿苷合成酶，其催化 rRNA 的特定位点修饰，对于核糖体的组装、功能和稳定性至关重要，其激活推测能够提升核糖体功能，从而增强蛋白质合成能力，有利于代谢途径相关酶的高效表达。抑制 ftsA 使产量提高约 3.0 倍。该基因编码细胞分裂蛋白，抑制后可能导致细胞延长和体积增大，从而增加代谢产物的积累空间，同时减轻细胞分裂带来的资源消耗，使更多资源用于次级代谢产物合成。值得注意的是，当研究团队将 rluC 的激活与 ftsA 的抑制结合使用时，紫色素的产量实现了 3.7 倍的提升，远高于单一调控的效果，展现了多靶点联合调控的协同潜力。

图 | 全基因组筛选提升紫色素产量

该研究不仅在大肠杆菌中展示了系统的强大能力，还验证了其跨物种的适用性。在 恋臭假单胞菌（Pseudomonas putida）中，该系统同样能够实现基因的激活与抑制，说明其潜力不限于单一宿主。这为其在更广泛的工业微生物中应用奠定了基础。总体而言，dxCas9-CRP 系统的建立为细菌代谢工程提供了新的通用工具。它既可用于探索复杂的基因调控网络，也可用于优化代谢通路，构建高效的细胞工厂。未来，这一平台在生物医药、化学品和燃料生产等领域都有望发挥重要作用。

1.Soo Young Moon et al, Dual-mode CRISPRa/i for genome-scale metabolic rewiring in Escherichia coli, Nucleic Acids Research (2025). DOI: 10.1093/nar/gkaf818

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