乙型脑炎减毒活疫苗猪胰蛋白酶残留量ELISA的建立及验证

中文摘要

目的建立并验证乙型脑炎减毒活疫苗猪胰蛋白酶残留量ELISA检测方法。

方法应用双抗体夹心ELISA建立乙型脑炎减毒活疫苗猪胰蛋白酶残留量的检测方法，对该方法的准确度、重复性、中间精密度、耐用性、线性、专属性、检测限和定量限进行验证。

结果供试品的加标回收率为92.23%~118.16%。同批供试品的变异系数（coefficient of variation，CV）为6.6%~12.1%。不同实验人员、不同实验日期、不同批次试剂盒检测同批供试品的CV分别为8.1%~11.5%、6.7%~8.5%、8.4%~9.6%。在（37±1） ℃温度范围内供试品回收率差异无统计学意义（F=0.43，P=0.662）。在3.12~200.00 ng/mL范围内线性关系良好，决定系数均大于0.98。方法与供试品基质无交叉反应。检测限和定量限分别为1.25和3.12 ng/mL。

结论建立的方法准确度、重复性、中间精密度、耐用性、线性、专属性良好，适用于乙型脑炎减毒活疫苗猪胰蛋白酶残留量的检测。

正文

动物源性胰蛋白酶是生物制品生产中的常用原料，在原代及传代细胞基质的制备中具有重要作用。胰蛋白酶属工艺相关杂质，疫苗生产和研发过程中应对其进行分析、评估并制定相应的控制策略，以尽可能减少或消除其对疫苗安全性和有效性的影响。成都生物制品研究所有限责任公司（成都公司）在乙型脑炎减毒活疫苗（乙脑疫苗）的生产过程中使用猪胰蛋白酶对金黄地鼠肾组织进行消化，经充分消化后将猪胰蛋白酶移除，并在后续生产环节中多次清洗残留，进入下游生产环节的猪胰蛋白酶残留是微量或痕量的。分光光度法虽操作简便，但难以检测微量物质；高效液相色谱法和质谱法虽灵敏度和特异性高，但设备运行和维护成本高，不适合大规模检测；ELISA具有灵敏度高、特异性强、重复性好、快速简便等优点，已被广泛应用于牛血清白蛋白、宿主细胞蛋白等残留的检测，可尝试作为乙脑疫苗猪胰蛋白酶残留的检测方法。基于此，本研究拟应用双抗体夹心ELISA建立乙脑疫苗猪胰蛋白酶残留的定量检测体系，以期加强对猪胰蛋白酶残留的控制，为乙脑疫苗的质量提供数据支撑。

1

材料与方法

1.1

材料和仪器

猪胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；人血白蛋白购自成都蓉生药业有限责任公司；109培养基、MEM由成都公司病毒性疫苗一室自制；金黄地鼠肾组织由成都公司提供；Multiskan GO全波长读数仪购自美国ThermoFisher Scientific公司。

1.2

方法的建立

根据猪胰蛋白酶酶联免疫吸附测定试剂盒说明书要求，往预先包被有猪胰蛋白酶捕获抗体的微孔中，依次加入标准品（200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.12 ng/mL）、内参、样品、生物素标记的检测抗体、辣根过氧化物酶结合物，中间经过温育和洗涤，用底物显色，终止后在450 nm波长下测定吸光度值；样本吸光度值与其猪胰蛋白酶残留量成正相关，使用ELISACalc软件绘制出四参数逻辑函数的标准曲线，计算样品浓度。

1.3

方法验证

1.3.1　准确度取原代地鼠肾（primary hamster kidney，PHK）细胞培养液1批作为供试品，检测6次，以6次检测结果的均值为其猪胰蛋白酶含量理论值。根据含量大小对其进行适宜稀释后，分别和100.00、50.00、25.00 ng/mL标准品等体积混合，制成试液A、B、C，检测3次，计算回收率。可接受标准：回收率在70%~125%。

1.3.2　重复性取PHK细胞培养液3批，分别检测6次。计算每批供试品检测结果的变异系数（coefficient of variation，CV）。可接受标准：CV≤15%。

1.3.3中间精密度

1.3.3.1　不同实验人员之间的精密度取PHK细胞培养液3批，由2名实验人员在同一日期使用同一批次试剂盒分别检测6次。可接受标准：CV≤15%。

1.3.3.2　不同实验日期之间的精密度取PHK细胞培养液3批，由同一实验人员在3个不同日期使用同一批次试剂盒分别检测3次。可接受标准：CV≤15%。

1.3.3.3　不同批次试剂盒之间的精密度取PHK细胞培养液3批，由同一实验人员在同一日期使用2个批次试剂盒分别检测6次。可接受标准：CV≤15%。

1.3.4　耐用性以试剂盒标准品1—7（200.00、100.00、50.00、25.00、12.50、6.25、3.12 ng/mL）为供试品，分别将加样后孵放温度和加生物素化抗体后孵放温度设置为36 ℃和36 ℃（条件1）、38 ℃和38 ℃（条件2）、37 ℃和37 ℃（条件3，正常温度），其余条件不变，进行检测。计算3种条件下各标准品的检测结果及CV，并采用SPSS 25软件对各标准品的回收率进行随机区组方差分析。可接受标准：CV≤15%，回收率之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.3.5　线性以试剂盒标准品1—7为供试品，检测3次，计算决定系数（R2）。可接受标准：R2≥0.98。

1.3.6　专属性乙脑疫苗生产过程中先后以109培养基和MEM培养PHK细胞，最终产品中添加人血白蛋白作为稳定剂。专属性实验检测1×、2×、4×、8×、16×梯度稀释的生产用浓度的109培养基、MEM和人血白蛋白溶液。可接受标准：供试品无猪胰蛋白酶检出。

1.3.7　检测限和定量限

1.3.7.1　检测限对试剂盒标准品（200 ng/mL）进行梯度稀释，得到20.00、10.00、5.00、2.50、1.25、0.62、0.31、0.16、0.08 ng/mL系列溶液，并进行检测。最低能检测出且回收率在70%~125%的含量即为检测限。取试剂盒标准品，稀释至检测限浓度，检测3次，应均可检出。

1.3.7.2　定量限参考试剂盒说明书上的定量限3.12 ng/mL，检测2.50、3.00、3.50 ng/mL标准品溶液6次，进行定量限的准确度和重复性确认。计算检测结果及其回收率。计算CV。同时满足回收率在70%~125%且CV≤15%的最低含量即为定量限。

2

结果

2.1

准确度

PHK细胞培养液猪胰蛋白酶残留量的6次检测结果分别为431.41、434.63、484.25、489.33、497.54、478.27 ng/mL，理论值取上述结果的均值即469.24 ng/mL。将其进行10倍稀释后加标制成的试液A—C的回收率为92.23%~118.16%，符合可接受标准，准确度良好，见表1。

2.2

重复性

同批PHK细胞培养液猪胰蛋白酶残留量的CV为6.6%~12.1%，符合可接受标准，重复性良好，见表2。

2.3

中间精密度

不同实验人员、不同实验日期、不同批次试剂盒检测同批PHK细胞培养液的猪胰蛋白酶残留量的CV分别为8.1%~11.5%、6.7%~8.5%、8.4%~9.6%，均符合可接受标准，中间精密度良好，见表3—5。

2.4

耐用性

不同条件下标准品猪胰蛋白酶含量的CV为3.0%~7.6%，对不同条件下标准品的回收率进行随机区组方差分析，F=0.43，P=0.662，回收率之间的差异无统计学意义，符合可接受标准，耐用性良好，见表6。

2.5

线性

结果显示，线性方程R2均大于0.98，说明在3.12~200.00 ng/mL范围内，猪胰蛋白酶含量与吸光度值之间呈现良好的线性，见表7。

2.6

专属性

结果显示，该法与109细胞培养基、MEM和人血白蛋白均无交叉反应，专属性良好。

2.7

检测限和定量限

结果显示，1.25 ng/mL标准品检测达到准确度标准（回收率为70%~125%），未达到精密度标准（CV≤15%），可认为该浓度是检测限，见表8—9。检测2.50、3.00和3.50 ng/mL标准品溶液的回收率分别为89.20%~104.00%、85.33%~119.67%、89.43%~105.14%，CV分别为5.0%、11.3%、6.3%，均符合规定要求；考虑到标准曲线最低浓度（3.12 ng/mL）在2.50~3.50 ng/mL区间，将定量限定为3.12 ng/mL，见表10。

3

采用细胞培养技术获得疫苗抗原成分，是疫苗企业普遍采用的生产方式。其中用于细胞消化的猪胰蛋白酶作为外源蛋白，构成了疫苗生产工艺相关杂质的重要组成部分，其残留量是产品的关键质量属性。相关法规要求对猪胰蛋白酶进行定量检测，并通过下游工艺策略有效去除猪胰蛋白酶残留，以生产纯度高、效力好和质量优的疫苗产品。本研究应用双抗体夹心ELISA建立了成都公司乙脑疫苗猪胰蛋白酶残留的定量检测方法，验证结果显示，该方法的加标回收率为92.23%~118.16%，各项验证参数的变异系数为6.6%~12.1%，检测限为1.25 ng/mL，定量限为3.12 ng/mL，与样品基质无交叉反应，证明该方法准确度高、精密度好、灵敏度高、特异性强，可用于成都公司乙脑疫苗猪胰蛋白酶残留的质量控制分析。基于该方法，可定期在乙脑疫苗生产过程中去除猪胰蛋白酶残留的关键工艺步骤处及关键中间品处取样检测，分析不同生产阶段的猪胰蛋白酶残留水平，建立相应的质控标准，以评估生产工艺去除猪胰蛋白酶残留的有效性和稳定性，为猪胰蛋白酶残留控制策略的持续优化提供依据，从而实现对该项工艺相关杂质的全过程控制和全生命周期管理，保障乙脑疫苗产品质量。

本次乙脑疫苗猪胰蛋白酶残留量ELISA检测方法的验证，涉及准确度、重复性、中间精密度、耐用性、线性、专属性、检测限和定量限等参数，验证结果均达到了分析方法验证相关法规要求。考虑到后续将定期对乙脑疫苗猪胰蛋白酶残留量进行检测，还需重点关注ELISA试剂盒的批间和批内的一致性考察。可通过建立第三方质控品，并与供试品同时进行试验，记录其检测结果及所用试剂盒批号，对以上数据进行统计分析，评估试剂盒的批间差异和批内差异是否在可接受范围，从而确保得到准确可靠的猪胰蛋白酶残留量检测数据。另外，本次方法验证所用样本仅来自细胞培养阶段的关键质控点，病毒培养阶段的关键质控点样本则因其猪胰蛋白酶残留量处于痕量或不可检出水平、风险可控，未纳入验证范畴；考虑到乙型脑炎病毒对猪胰蛋白酶残留量检测可能存在干扰，仍需进行相应的补充验证工作。同时需结合疫苗生产的变更事项，以及分析方法技术的发展，对分析方法进行持续优化，并设定合理的再验证周期，确保分析方法符合要求。

综上所述，成都公司乙脑疫苗猪胰蛋白酶残留量ELISA检测方法的建立，为评估乙脑疫苗生产工艺去除猪胰蛋白酶残留的能力奠定了重要的方法学基础，可为乙脑疫苗的工艺相关杂质控制策略的持续提升提供重要依据，为乙脑疫苗的产品质量提供重要保障。

作者

江莉1 李家奇1 曾昭萍1 吕冰凌1 许敬敏2 汪小磊3 刘菊1

1成都生物制品研究所有限责任公司质量检定室，四川省疫苗工程技术研究中心，成都 610023；2成都生物制品研究所有限责任公司质量运营部，成都 610023；3成都生物制品研究所有限责任公司病毒性疫苗一室，成都 610023

通信作者：刘菊，

Email：362546880@qq.com

引用本文：江莉, 李家奇, 曾昭萍, 等.乙型脑炎减毒活疫苗猪胰蛋白酶残留量ELISA的建立及验证[J]. 国际生物制品学杂志, 2025, 48(4): 253-258.

DOI: 10.3760/cma.j.cn311962-20241010-00063

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