基于AI设计适配体，偶联至LNP表面，实现靶向递送

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离体 CAR-T 细胞开发面临复杂的工艺和高昂的成本，使得人们开始全力攻克 In vivo CAR-T。根据递送载体的不同，In vivo CAR-T 可分为病毒载体和非病毒载体。在非病毒载体中，近一年多以来，基于 mRNA-LNP 技术路线的 In vivo CAR-T 药物开发掀起了一股细胞治疗领域的小热潮。

近日，虹信生物在新英格兰医学杂志发表文章：In vivo CD19-CAR T-Cell Therapy for Refractory Systemic Lupus Erythematosus，这项研究初步证实 In vivo CAR T 候选药物 HN2301 在系统性红斑狼疮(SLE)病人体内的有效性和安全性。HN2301 是一款基于 mRNA-LNP 技术路线的体内 CAR-T 药物，药物活性成份为 anti CD19 CAR-mRNA，递送载体为靶向 T 细胞表面分子 CD8 的抗体偶联 LNP（tLNP）。静脉注射 HN2301，tLNP 将 anti CD19 CAR-mRNA 递送至 CD8+T 细胞里面，表达生成体内 CAR-T 细胞，靶向并杀死 B 细胞。该论文的发表宣告 mRNA-LNP 技术路线的 In vivo CAR-T 首次在人体内获得临床验证。

传统四组份 LNP 的 安全性和有效性已经在真实世界得到大规模验证。然而，静脉注射后，传统 LNP 大部分会聚集到肝脏，而在富含 CD4+T 细胞的器官分布很少，例如肝脏，骨髓，胸腺。因此，In vivo CAR-T 首先要解决靶向递送，人们已做出一些尝试：

第一，开发选择性器官靶向脂质纳米颗粒递送系统SORT LNP，即在传统 LNP 传统 4 组分配方中加入了第 5 种脂质成分，以实现 mRNA 的肝外靶向递送。尽管 SORT LNP 能够实现器官水平的靶向性，但是，在细胞水平的靶向性非常有限，特别是对于免疫细胞亚群。

第二，在 LNP 表面修饰配体，使其能够与靶细胞表面的受体发生特异性结合，从而介导 LNP 被靶细胞吞噬，实现主动靶向。其中，单抗被广泛应用与开发靶向特定免疫细胞的 LNP。抗体偶联的 LNP 也存在一些缺陷，例如，Fc 介导的免疫激活，影响 LNP 摄取的空间位阻及高昂的成本。

除了抗体以外，还有没有其他的配体，能够与 LNP 偶联，使其实现主动靶向递送呢？有人将目光转向了适配体（Aptmer）。适配体是一种具有空间三维结构的单链短核苷酸分子（RNA/DNA），适配体不通过碱基配对，而是类似于抗体，依靠其三维结构特异性结合配体。适配体靶标分子可以为金属离子、小分子、细菌或者病毒及疾病相关的蛋白，已经广泛应用于疾病的诊断治疗。

近日，AtomBio 研究团队在 bioRxiv 发表文章：Lipid Nanoparticles with Aptamers Enable Targeted mRNA Delivery to CD4⁺ T Cells，他们将适配体 Apt62 偶联至 LNP 表面，利用 Apt62 与 CD4 发生特异性结合，将 mRNA 靶向递送至 CD4+T 细胞。Apt62LNP 针对 CD4+T 细胞的转染效率依赖于其表面的 Apt62 配体密度，而且，与非靶向 SM102 LNP 相比，Apt62LNP 将 mRNA 递送至脾脏中的效率提升数十倍。这项研究为 LNP 偶联适配体，尤其是基于 AI 优化增强的适配体，实现体内靶向递送，生成 In vivo CAR-T 提供了一种新型载体路线。

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AptaBLE AI 模型高效设计适配体

该文章选择的 Apt62 早已经被证实可以以纳摩尔亲和力结合 CD4，破坏 gp120-CD4 相互作用，并抑制 HIV-1 进入多个表达 CD4 的细胞系。那如果是未知的靶标分子，如何获得与其能够发生特异性结合的适配体序列呢？

通常，经典的做法是采用指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment)进行体外筛选适配体序列。在 SELEX 体外筛选过程中，将靶物质与随机的单链寡核苷酸库混合，分离出与靶物质结合的核酸分子后，通过 PCR 对这些结合的核酸进行扩增，生成新的核酸文库，使与靶物质具有高亲和力的核酸分子数量增加，以便进行下一轮筛选。经过多轮重复筛选和扩增，文库中的高亲和力核酸分子逐渐占据主导地位。最后，经过测序分析、亲和力评估、特异性评估及结构分析，筛选出最优的适配体核酸序列。然而，SELEX 是一项耗时费力的工作，通常需要 1-3 个月的迭代轮次，并且分离出高亲和力结合剂的概率通常很低。

AtomBio 是一家基于 AI 技术设计优化适配体的公司，他们开发了一种基于深度学习的人工智能模型 AptaBLE，根据蛋白质-适配体相互作用的专有数据进行训练，使我们能够以前所未有的速度、准确性和效率设计和优化适配体。AptaBL 具有以下优势：第一，既能从头合成多样化的候选适配体库，又可优化现有的适配体；第二，设计具有耐核酸酶降解的适配体，无需化学修饰即可实现；第三，脱靶概率将至极低。

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Apt62LNP 的转染效率和体内分布

Apt62LNP 制备过程为：先使用微流控设备制备 mRNA-LNP，然后与硫醇化适配体 Apt62 进行表面偶联。适配体偶联制剂设计为理论上每个 LNP 连接 25 个或者 100 个适配体。非靶向 SM102 和 MC3 LNP 的平均尺寸分别为 90 和 98 nm。适配体偶联并没有显着改变流体动力学直径，仅适度增加约 4-12 nm 的尺寸。所有制剂的 PDI 值均保持在 0.2 以下，表明单分散颗粒群。目标 LNP 的平均 zeta 电位为–2.7 mV，带负电荷的适配体附着使值略微偏移至负值，值在–3.0 和–3.8 mV 之间，表明对表面电荷的影响很小。所有制剂的包封效率均高于 95%。

与抗体偶联 LNP 相比， AptLNP 的一个关键优势是能够调整表面适配体密度，同时保持与抗体 LNP 相当的理化性质和整体完整性。

与常规 SM102 或者 MC3 LNP 转染剂量（75ng~600ng/105 细胞）相比，Apt62 LNP 未表现出明显的细胞毒性。在 CD4⁺ SUPT-1 和 CD4⁻ HSB-2 T 细胞系中，将适配体密度从 25:1 增加至 100:1，明显增强 Apt62 LNP 转染效率。在 CD4⁺ SUPT-1 细胞中，CD4 单克隆抗体修饰的 SM102 LNP 转染效率明显低于 Apt62 修饰的 SM102 LNP。

尾静脉注射不同配方的 Fluc-mRNA LNP 制剂，观察注射后其在小鼠体内分布情况，仅在肝脏和脾脏中检测到荧光信号分布。非靶向性的 MC3 或者 SM102 LNP 主要分布于小鼠肝脏中，在脾脏中未检测荧光信号。偶联适配体 Apt62，在脾脏中检测荧光信号分布。对于 MC3 LNP 来说，偶联适配体 Apt62 后，使得脾脏摄取率增加 20 倍；对于 SM102LNP 来说，偶联适配体 Apt62 后，使得脾脏摄取率增加 80 倍。此外，Apt62LNP 在小鼠体内是安全的，未造成器官/组织损伤或者引发显著的免疫反应。

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