颠覆认知！外泌体分离纯化技术大揭秘----北京泓九生命科学研究院

　　外泌体作为细胞间通信的关键媒介，近年来已成为生命科学和医学研究的热点。这些纳米级的细胞外囊泡携带蛋白质、核酸和脂质等生物活性分子，在疾病诊断、治疗和预后评估中展现出巨大潜力。

　　2025年6月23日，北京泓九生命科学研究院联合中国科学院生物物理研究所主导制订了植物源性细胞外囊泡分离纯化团体标准，T/CIET 1686-2025植物源性细胞外囊泡（PDEVs）分离纯化工艺技术规范。并助力山西原生肽科技有限公司斩获国内行业首个“黄芪外泌体”食品生产许可资质，实现了“黄芪外泌体”相关技术在食品领域应用的合法合规化落地，更标志着该技术从实验室迈向产业化应用的突破，推动了“黄芪外泌体”从科研成果走向市场应用奠定了关键基础。

　　本文将系统介绍九种主要的外泌体分离纯化技术，从经典的超速离心法到新兴的微流控技术，揭示各种方法的科学原理、独特优势与应用局限，为外泌体研究者提供全面的技术参考。

　　1、差速超速离心法

　　差速超速离心法基于外泌体与其他细胞成分在尺寸和密度上的差异，通过一系列递增离心力的超速离心步骤，逐步去除非外泌体成分，最终实现外泌体的沉淀和回收。

　　该方法首先通过低速离心（300-2000×g）去除细胞和细胞碎片，随后通过中等速度离心（10000-20000×g）去除大的细胞器和微粒，最后通过超高速离心（100000-200000×g）将外泌体沉淀下来。整个过程通常需要多次重复离心步骤以提高纯度。

　　差速超速离心的主要优势在于能够处理大体积样本且无需引入外源试剂，避免了化学污染。该方法已被广泛应用于各种生物样本，如细胞培养上清、血清、血浆的外泌体分离。然而，这种方法需要昂贵的超速离心设备，操作复杂耗时，且高离心力可能损伤外泌体结构完整性，影响下游功能分析。

　　2、密度梯度离心法

　　密度梯度离心法是在差速离心基础上进一步发展的高分辨率分离技术。该方法将超速离心与密度梯度介质相结合，如蔗糖或碘克沙醇，利用外泌体特定密度范围（1.13-1.21 g/mL）实现精细分离。

　　具体操作流程包括：首先进行样品预处理去除大颗粒杂质；然后制备连续或不连续密度梯度；将外泌体粗提物缓慢加于梯度顶部；进行长时间超速离心（通常≥16小时）；最后在目标密度区间收集外泌体富集层，并通过稀释后再次超速离心去除梯度介质。

　　密度梯度离心法的突出优势是能够有效分离外泌体与非囊泡颗粒（如蛋白质聚集体），获得高纯度外泌体制备物。密度梯度的缓冲作用还能减少离心力对外泌体的机械损伤，更好地保持其结构和功能完整性，非常适合功能学研究和内容物分析。

　　3、超滤离心法

　　超滤离心法利用截留分子量（MWCO）确定的超滤膜，根据外泌体的大小和分子量实现分离富集。该方法通常采用0.1、0.22和0.45微米系列膜过滤器先去除细胞、碎片和较大微粒，然后使用适当孔径的超滤膜（通常为10-1000 kD）分离可溶性蛋白质和聚集性蛋白质。

　　超滤离心法的操作简单省时，样本处理量大，且不影响外泌体的生物活性。该方法特别适用于浓缩已通过其他方法分离的外泌体，也可作为主要分离技术使用。一种高级形式是切向流过滤（TFF），通过平行于膜表面的流动减轻膜污染，实现更大规模的外泌体分离纯化。

　　4、免疫磁珠法

　　免疫磁珠法基于抗原-抗体特异性结合原理，利用表面固定CD9、CD63、CD81等外泌体特异性抗体的磁珠作为固相载体，从复杂样本中特异性捕获并分离外泌体。

　　该方法操作流程包括：样品预处理去除大颗粒杂质；抗体与磁珠偶联；样品与偶联磁珠孵育使外泌体特异性结合；磁性分离并洗涤去除非特异性结合物；最后通过适当条件，例如低pH缓冲液，来洗脱捕获的外泌体。

　　免疫磁珠法的最大优势是能够分离特定亚型的外泌体，纯度极高，非常适合qPCR、Western blot等高灵敏度分析和功能研究。该方法操作相对简单，不需要昂贵仪器设备，且能保持外泌体形态完整。作为一种温和的分离方法，它在分离纯化后能很好地保持外泌体功能。

　　5、PS亲和法

　　PS亲和法是一种新兴的外泌体分离技术，基于外泌体膜表面暴露的磷脂酰丝氨酸（PS）与特定配体（如Annexin V或Tim4蛋白）之间的高亲和力结合实现分离。

　　该方法将PS结合蛋白与磁珠或其他固相载体结合，利用亲和原理特异性捕获外泌体囊泡外的PS。与免疫磁珠法类似，PS亲和法获得的外泌体形态完整，纯度极高。由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，分离的外泌体可直接用于细胞共培养和体内注射研究。

　　2016年9月《Scientific Reports》发表的研究表明，PS法可提取相当高纯度的外泌体，为该方法提供了科学依据。该方法可以方便地获得高纯度的外泌体和其他来自细胞培养基和体液的细胞外囊泡，通过正常的微滤方法即可获得高产量。

　　6、分子尺寸排阻色谱法

　　分子尺寸排阻色谱法（SEC）是一种基于颗粒尺寸大小而非分子量的分离方法，利用多孔球状填料形成的色谱柱，使不同尺寸的分子以不同速率流出，实现外泌体的温和分离。

　　当样品流经SEC柱时，较小的蛋白质等杂质进入多孔中被滞留，而粒径较大的外泌体（30-150 nm）不会进入多孔而较快流出，从而在特定洗脱体积内被收集。外泌体介于大蛋白与更大细胞外囊泡之间，可通过精确控制洗脱条件实现有效分离。

　　SEC法的最大优势是分离过程温和无损伤，外泌体结构保持完整，非常适合功能学研究、标志物检测和内容物分析。操作相对简便，无需超速离心设备，分离效果较好，能有效去除蛋白污染。研究表明，SEC法的分离效率和纯度均优于离心法。

　　7、微流控分离法

　　微流控分离法是利用微纳米级尺寸的管道处理和操控流体的技术，基于免疫亲和力、大小和密度等外泌体物理和生物化学性质，实现微尺度分离，还可整合电泳和电磁操作等创新分选机制。

　　基于免疫亲和力的微流控技术通常在微流控装置底部涂有针对CD9、CD63和CD81等外泌体表面标志物的抗体，特异性捕获外泌体。此外，还有基于声学、介电泳等技术根据外泌体大小进行分离的微流控方法。

　　微流控技术的突出优势是自动化程度高，所需样本量少，分离速度快，在外泌体生物学功能研究和疾病临床诊断中具有极大潜力。然而，该方法缺乏标准化和大规模临床样本测试，也缺乏相关的方法验证而难以大规模应用。需要专门的昂贵设备，采样效率低，通道经常堵塞也是实际应用中的挑战。

　　8、聚合物沉淀法

　　聚合物沉淀法利用聚乙二醇（PEG）等聚合物与疏水性蛋白和脂质分子结合共沉淀，通过竞争性结合水分子降低外泌体溶解度，使其在低速离心条件下从生物样本中沉淀出来。

　　该方法操作简单，时间短，通常低于4小时，无需昂贵设备，适用于实验室常规分离，适合大体积样本，如血清、尿液等。目前大多数快速分离外泌体的商品化试剂盒都是基于此方法开发，如ExoQuick、TEI等。

　　然而，聚合物沉淀法可能会同时沉淀包括脂蛋白的非囊泡污染物，外泌体纯度较低。聚合物材料的混杂可能会影响下游分析，如Western blot和电镜鉴定。在沉淀前对样本进行预处理去除细胞碎片，结合尺寸排阻色谱或过滤膜有效去除蛋白聚合物及大分子囊泡，可提高外泌体纯度。

　　9、商品化试剂盒法

　　商品化外泌体提取试剂盒为研究人员提供了操作简便、标准化的分离方案。目前市面上的大多数试剂盒基本采用亲和法和沉淀法原理，在适当条件下充分孵育后，通过简单离心即可分离外泌体。

　　基于聚合物共沉淀的试剂盒，例如ExoQuick、TEI，可用于提取多种体液中的外泌体。通常将聚合物沉淀剂与样品4℃共孵育30分钟，然后室温1500g离心30分钟，即可获得外泌体沉淀。与超速离心法比较，试剂盒法更简便、耗时短，且能获得更高的外泌体产量。

　　最后：外泌体分离技术的未来发展方向

　　随着外泌体研究的深入和应用范围的扩展，外泌体分离技术正朝着更高纯度、更高效率、更低成本和更好标准化的方向发展。多种技术的联合应用已成为提高外泌体产量和纯度的有效策略，如超滤结合尺寸排阻色谱、聚合物沉淀结合密度梯度离心等。

　　自动化、微流控和芯片技术的发展将大大提高外泌体分离的效率和可重复性，为临床诊断和治疗应用奠定基础。新材料和新原理的引入，如新型亲和配体、智能响应材料等，也将为外泌体分离技术带来新的突破。

　　北京泓九生命科学研究院正逐步把科研成果从实验室带向产业应用。未来，研究院将继续在国际合作、技术创新与成果转化的道路上深耕前行，为提升人类健康水平、推动生命科学产业发展贡献力量。