《食品科学》：中国农业科学院李欣研究员等：温度波动通过调控磷酸化和亚硝基化对磷酸丙糖异构酶活性的影响

磷酸丙糖异构酶是影响宰后畜禽肉能量代谢进程的重要酶，参与催化二羟丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸之间的可逆反应。二羟丙酮磷酸和甘油醛-3-磷酸是糖酵解、糖异生、磷酸戊糖等途径的共同中间代谢物，在能量代谢中具有重要的调控作用。温度是决定磷酸丙糖异构酶活性的重要因素。磷酸丙糖异构酶在不同糖酵解速率的宰后肉中的活性不同，是影响肉品质的重要因素。温度可通过影响磷酸丙糖异构酶的活性位点、底物亲和性、酶的活性与非活性形式之间的转变从而调节其催化活性。磷酸化和亚硝基化是两种常见的蛋白质翻译后修饰，可通过靶向特定氨基酸残基添加修饰基团改变蛋白质的活性和相互作用。HeLa细胞中磷酸丙糖异构酶的磷酸化能够降低其活性进而干扰糖酵解进程。但也有研究表明，蛋白激酶介导的磷酸丙糖异构酶Ser58磷酸化使得其活性和糖酵解水平提高。

中国农业科学院农产品加工研究所的吴赛赛、王振宇、李欣*等研究通过在4 ℃体外条件下外源添加蛋白激酶A和

S

-亚硝基化谷胱甘肽构建磷酸丙糖异构酶修饰高表达模型，明晰磷酸化和亚硝基化对磷酸丙糖异构酶活性的影响，通过改变磷酸丙糖异构酶修饰高表达模型的体外温度条件，探究温度波动通过磷酸化和亚硝基化对磷酸丙糖异构酶活性的影响。

1 4 ℃体外条件下磷酸丙糖异构酶修饰高表达孵育模型的构建

宰后畜禽肉冷藏温度一般为4 ℃，因此选取4 ℃作对照组和恒温＋修饰组的孵育环境温度，构建磷酸丙糖异构酶修饰高表达孵育模型。如表1所示，随着孵育时间的延长，对照组样品的磷酸化水平在孵育3 h显著下降后逐渐上升。恒温＋修饰组的磷酸化水平逐渐上升，在孵育3 h时达到最大并趋于稳定。在孵育3 h和6 h时，对照组的磷酸化水平显著低于恒温＋修饰组，孵育12 h后两组样品磷酸化水平差异不显著（

P

＞0.05），说明外源添加蛋白激酶A可以有效加快磷酸丙糖异构酶磷酸化修饰，但随着孵育时间延长，蛋白激酶A的催化作用减弱，最终使得其磷酸化水平和对照组一致。

对照组样品的亚硝基化水平在孵育0～6 h的变化不具有规律性，但整体呈下降趋势并在孵育6 h时达到最小值，在孵育12 h时亚硝基化水平显著上升。恒温＋修饰组样品的亚硝基化水平在孵育早期呈下降趋势，孵育3 h时达到最小值后逐渐上升，说明

S

-亚硝基化谷胱甘肽有助于磷酸丙糖异构酶亚硝基化水平的稳定。在孵育1、6 h和12 h时，恒温＋修饰组的亚硝基化水平显著高于对照组（

P

＜0.05），这表明外源添加S-亚硝基化谷胱甘肽可以有效提高磷酸丙糖异构酶的亚硝基化水平。综上，磷酸丙糖异构酶修饰高表达孵育模型（恒温＋修饰组）符合实验设计。

为明确蛋白质磷酸化和亚硝基化在4 ℃体外条件下对磷酸丙糖异构酶活性的影响，分析2 个处理组的磷酸丙糖异构酶活性。如表1所示，随着孵育时间的延长，对照组的酶活性逐步下降。恒温＋修饰组的酶活性在孵育0～6 h无显著变化（

P

＞0.05），在孵育12 h后显著下降（

P

＜0.05）。说明在4 ℃体外条件下，外源添加

S

-亚硝基化谷胱甘肽和蛋白激酶A在孵育早期可以有效维持磷酸丙糖异构酶活性的稳定，延缓其活性下降。对照组的磷酸丙糖异构酶活性在孵育6 h时显著低于恒温＋修饰组（

P

＜0.05），这与两组的磷酸化和亚硝基化水平对比结果一致。

2 不同温度波动孵育条件下磷酸丙糖异构酶磷酸化水平分析

7 ℃（WB/T 1059—2016《肉与肉制品冷链物流作业规范》推荐肉品冷链温度阈值）和15 ℃（肉品冷链断链温度）是生鲜肉在冷链中常见温度的波动数值，因此选取4 ℃和15 ℃探究温度波动对磷酸丙糖异构酶的影响；选取4 ℃和7 ℃并提高温度波动频率，探究温度波动频率对磷酸丙糖异构酶的影响。如图2所示，恒温＋修饰组和幅度波动＋修饰组样品的磷酸化水平随着孵育时间的延长先上升，在孵育3 h时达到最大值后下降，频率波动＋修饰组的磷酸丙糖异构酶磷酸化水平整体呈下降趋势。频率波动＋修饰组样品的磷酸化水平在孵育1 h时仅显著低于恒温＋修饰组，与幅度波动＋修饰组样品的磷酸化水平无显著差异。在孵育3 h和6 h显著低于恒温＋修饰组和幅度波动＋修饰组。在孵育12 h时，幅度波动＋修饰组和频率波动＋修饰组样品的磷酸化水平均显著低于恒温＋修饰组（

P

＜0.05），说明温度波动能够抑制磷酸丙糖异构酶磷酸化水平，且温度频率波动对磷酸丙糖异构酶磷酸化的抑制作用更明显。

3 不同温度波动孵育条件下磷酸丙糖异构酶亚硝基化水平分析

如图3所示，3 个处理组样品的亚硝基化水平随着孵育时间的延长先下降后上升，在孵育1 h时幅度波动＋修饰组的亚硝基化水平明显高于恒温＋修饰组，在孵育3 h时频率波动＋修饰组显著高于其余2 个处理组，在孵育6 h时2 个处理组明显均低于恒温＋修饰组（

P

＜0.05），在孵育12 h时3 个处理组的亚硝基化水平无显著差异。这说明温度幅度波动和频率波动均会促进磷酸丙糖异构酶的亚硝基化修饰。

4 不同温度波动孵育条件下磷酸丙糖异构酶活性和表达量的变化

如图4所示，幅度波动＋修饰组和频率波动＋修饰组的磷酸丙糖异构酶活性在孵育1 h时达到最大值，并显著高于恒温＋修饰组（

P

＜0.05），随着孵育时间的继续延长逐渐下降。在孵育12 h时3 个处理组样品的磷酸丙糖异构酶活性显著下降。此外，在孵育1 h时幅度波动＋修饰组样品的亚硝基化水平和磷酸丙糖异构酶活性明显高于恒温＋修饰组（图3、4），频率波动＋修饰组样品的磷酸化水平明显低于恒温＋修饰组（图2）。因此温度波动对蛋白质磷酸化和亚硝基化的改变影响了磷酸丙糖异构酶的活性。

为进一步明确磷酸丙糖异构酶活性变化的内在因素，对不同温度波动处理组的磷酸丙糖异构酶表达量进行分析。如图5所示，恒温＋修饰组和频率波动＋修饰组的磷酸丙糖异构酶表达量随着孵育时间的延长略有下降。频率波动＋修饰组磷酸丙糖异构酶表达量在孵育3 h显著高于其他两组，幅度波动＋修饰组的磷酸丙糖异构酶表达量在孵育12 h时显著高于其他两组，其余时间点无显著差异。3 个处理组的磷酸丙糖异构酶表达量变化与其活性变化不一致，说明磷酸丙糖异构酶的活性与表达量没有直接联系。

5 不同温度波动孵育条件下磷酸丙糖异构酶二级结构的变化

为进一步明确磷酸丙糖异构酶活性变化的内在因素，对磷酸丙糖异构酶结构进行分析。如图6所示，随着孵育时间的延长，所有磷酸丙糖异构酶样品均在1 700～1 600 cm-1范围出现酰胺I带的特征峰，在3 100～3 600 cm-1范围出现酰胺A带的宽峰，前者是蛋白质中C＝O伸缩振动造成，后者是蛋白质中N—H伸缩振动引起，但该峰谱也可能是水分子中的O—H拉伸造成。其中恒温＋修饰组在孵育6 h时峰值达到最大，幅度波动＋修饰组和频率波动＋修饰组在孵育3 h时峰值达到最大。此外，恒温＋修饰组孵育3～6 h在2 950～2 840 cm-1（酰胺B带）范围出现了特征峰，但幅度波动＋修饰组和频率波动＋修饰组在孵育1～3 h内出现特征峰。2 950～2 840 cm-1波段出现吸收峰一般由C—H伸缩振动引起。这表明温度波动可能延缓了磷酸丙糖异构酶的解聚。酰胺II带附近吸收峰位置和强度随无显著变化，但在该范围内有明显的吸收峰。

为进一步探讨磷酸丙糖异构酶结构的变化，对1 600～1 700 cm-1范围的酰胺I带进行量化分析，结果如表2所示。孵育时间、温度波动条件以及二者间的交互作用与α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲含量显著相关。孵育1 h时，幅度波动＋修饰组的β-转角相对含量高于恒温＋修饰组，无规卷曲相对含量低于恒温＋修饰组。这与孵育1 h时的幅度波动＋修饰组磷酸丙糖异构酶活性变化一致。孵育6 h时，恒温＋修饰组的α-螺旋和无规卷曲相对含量显著高于幅度波动＋修饰组和频率波动＋修饰组，β-折叠和β-转角明显低于幅度波动＋修饰组和频率波动＋修饰组。孵育12 h时，3 个处理组的α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲含量无显著差异，说明3 个处理组样品的二级结构含量变化最终是相似的。

6 不同温度波动孵育条件下磷酸丙糖异构酶形态的变化

如图7所示，0 h时磷酸丙糖异构酶的尺寸在120～200 nm范围内，12 h后的磷酸丙糖异构酶尺寸明显缩小至30～50 nm。其高度由1.4 nm左右下降到0.4 nm左右，这与磷酸丙糖异构酶活性在孵育12 h后显著下降的结果相印证，说明温度波动不改变磷酸丙糖异构酶的最终形态。

7 结论

7.1 外源添加蛋白激酶A和S-亚硝基化谷胱甘肽促进酶修饰水平

蛋白激酶A是最常见促进蛋白质磷酸化修饰的酶，可以改变能量代谢酶活性。它通过将ATP上的磷酸基团转移到蛋白质的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上，使蛋白质发生磷酸化。磷酸丙糖异构酶Ser58位点是磷酸化的位点之一，蛋白激酶A将磷酸基团直接转移到该位点，发生磷酸化修饰进而提高酶活性。

S

-亚硝基化谷胱甘肽是最常见的NO供体之一，可直接将NO转移到半胱氨酸巯基上，特异性结合形成

S

-亚硝基硫醇，进而提高亚硝基化水平。Romero等研究发现

S

-亚硝基化半胱氨酸介导的

S

-亚硝基化抑制磷酸丙糖异构酶活性，这与本研究结果不一致，可能是半胱氨酸介导亚硝基化修饰的原理与

S

-硝基化谷胱甘肽不完全相同。因此，亚硝基化对磷酸丙糖异构酶的影响可能与NO供体的选择有关。众多研究表明酶的活性与其结构变化关系密切。磷酸丙糖异构酶的亚基中存在TIM桶结构，其活性催化中心位于桶的中心。蛋白激酶A提供的磷酸基团与

S

-亚硝基化谷胱甘肽释放的NO均可特异性结合氨基酸残基位点，使得磷酸丙糖异构酶结构侧链上的底物或底物类似物与二者结合，导致其TIM桶内催化中心上的铰链盖变化，酶的活性提高。

7.2 温度波动影响磷酸化和亚硝基化对酶活性的促进作用

能量代谢酶可以通过改变温度影响能量代谢酶活性，进而改变其上下游产物的亲和力。磷酸丙糖异构酶是参与多种能量代谢途径的中间代谢物，它的每一个单体中都有一套完整的催化残基，因此温度波动幅度和频率可能使得磷酸丙糖异构酶亚硝基化水平在孵育1 h时下降，但随着磷酸丙糖异构酶的解聚，磷酸丙糖异构酶暴露更多的亚硝基化修饰位点，亚硝基谷胱甘肽提供的NO转移到对应位点上，使得亚硝基化水平上升，但温度是影响NO稳定性的重要因素，因此各组样品在亚硝基化水平达到最大值后均下降并具有差异性，在孵育6 h时各组亚硝基化水平无差异。此外，温度波动影响了酶的磷酸基团特异性结合位点，从而扰乱磷酸丙糖异构酶的磷酸化位点与磷酸基团的结合，降低磷酸丙糖异构酶磷酸化水平。在孵育1 h时，两个波动组的酶活高于恒温＋修饰组，其中幅度波动＋修饰组磷酸丙糖异构酶的亚硝基化水平明显高于恒温＋修饰组，频率波动＋修饰组磷酸丙糖异构酶的磷酸化水平明显低于恒温＋修饰组。因此在孵育早期温度波动频率增大可能降低了蛋白质磷酸化对酶活性的促进作用，温度幅度增大提高了蛋白质亚硝基化对酶活性的促进作用。此外，磷酸丙糖异构酶的结构从具有活性的同源二聚体转化为不具有活性且不稳定的单聚体形式时，其容易被水解，因此随着孵育时间的延长，该酶的活性降低，温度波动幅度或频率的变化不会改变酶活性降低的结果。

7.3温度波动加剧磷酸化和亚硝基化对酶结构的解聚

傅里叶变换红外光谱一般通过酰胺I带（C＝O伸缩振动）、酰胺II带（N—H平面内弯曲振动和C—N伸缩振动）、酰胺III带（C—O和C—O—C振动）、酰胺A带（N—H伸缩振动）和酰胺B带（C—H伸缩振动）反映蛋白质结构的变化。所有样品在酰胺A带的3 100～3 600 cm-1出现宽峰，这可能是由磷酸丙糖异构酶中N—H伸缩振动引起，但该峰也可能是由水分子的O—H拉伸造成，在酰胺II带附近吸收峰位置和强度随无显著变化，但在该范围附近有明显的吸收峰，这说明高磷酸化和亚硝基化水平的磷酸丙糖异构酶结构中可能存在平行的

-折叠结构。

-折叠结构常见于蛋白质内部折叠区域，但分子间的

-折叠结构易转变为

-转角结构，部分

-转角结构相对不稳定，易转变为无规卷曲结构。无规卷曲含量增加表明磷酸丙糖异构酶的二级结构从有序向无序转化。因此温度波动幅度和频率均延缓了高磷酸化和亚硝基化的磷酸丙糖异构酶蛋白内部折叠结构从有序向无序的转化。此外，段丹辉发现不同温度条件下蛋白质二级结构的解折叠顺序相似，这与本研究的结论一致，因此温度波动幅度和频率的变化不会改变磷酸丙糖异构酶最终的二级结构含量。

进一步对磷酸丙糖异构酶的形态分析发现孵育12 h的样品形态小于孵育0 h的样品，这是因为磷酸丙糖异构酶的结构会从保守的四聚体或二聚体解聚成不稳定且不具有活性的单聚体。研究表明，二聚体是构建磷酸丙糖异构酶催化活性位点的先决条件，二聚体界面间活性位点残基的氢键相互作用并形成紧密网络，其亚基解离导致氢键断裂，酶活性丧失，因此，磷酸丙糖异构酶可能从二聚体或四聚体逐渐解聚为单聚体，使得酶形态缩小、活性下降，但孵育12 h时3 组样品的形态相近，这表明温度波动不会改变磷酸丙糖异构酶的最终形态，这与本研究中酶活性和二级结构定量分析的结论相印证。

8 结论

蛋白激酶A和

S

-亚硝基谷胱甘肽体外介导的磷酸化和亚硝基化在4 ℃恒温条件下能够增强磷酸丙糖异构酶活性。与4 ℃恒温＋修饰组相比，磷酸丙糖异构酶经过温度幅度波动或频率波动处理，其磷酸化水平下降，亚硝基化水平和活性相对提高，其结构从有序向无序转变的过程减缓，但不改变其最终形态。因此，温度幅度或频率波动能够通过降低磷酸化水平、提高亚硝基化水平促进酶活性提升，稳定磷酸丙糖异构酶的结构。

本文《温度波动通过调控磷酸化和亚硝基化对磷酸丙糖异构酶活性的影响》来源于《食品科学》2025年46卷第9期139-147页，作者：吴赛赛，王振宇，摆玉蔷，侯成立，饶伟丽，李 欣*，张志胜，张德权。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20240924-180。点击下方 阅读原文 即可查看文章相关信息。

实习编辑：刘芯；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

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