ADC概论：ADC的全面总结

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引言

抗体偶联药物(ADC)是由靶向特异性抗原的单克隆抗体与小分子细胞毒性药物通过连接子链接而成,兼具传统小分子化疗的强大杀伤效应及抗体药物的肿瘤靶向性。ADC由三个主要部分组成：负责选择性识别癌细胞表面抗原的抗体，负责杀死癌细胞的药物有效载荷，以及连接抗体和有效载荷的连接子。

2000年，第一个ADC药物Mylotarg获批上市，开启了ADC的时代。随着抗体工程在随后的10年间取得了相当大的进展，允许更多的位点特异性偶联，提高了ADC的均一性和稳定性。新的第二代和第三代ADC已经进入临床，以期获得更好的治疗效果和安全性。几十种基于半胱氨酸残基、非天然氨基酸或分子工程模式的生物偶联技术也已经在临床前研究获得了验证。截止2024年，全球已经批准上市了16个ADC药物，还有上百个ADC药物正处于临床研究阶段。可以预期授予ADC的上市批准将更加多样化，其适用的疾病适应症也将更加多样化。

一、有效载荷

1. 微管破坏药物

金盏花素

Auristatins是ADC中使用的重要有效载荷，最著名的家族成员MMAE存在于两种上市药物Adcetris和Polivy中。目前，超过10种以金盏花素（如MMAE）或一甲基金盏花素F（MMAF）为有效载荷的ADC正在进行临床试验。

上图描述了auristatine及其常用的连接位点。金盏花素的构效关系（SAR）已被广泛研究，主要集中在末端亚单位：P1（N-末端）和P5（C-末端），最常见的方法是在P1上引入氨基甲酸酯功能。

2015年，西雅图遗传学的研究人员将ADC有效载荷的范围扩大到包括叔胺，特别是N-二甲基auristatine，首次通过铵键将药物与单克隆抗体结合。所得ADCs在生理条件下稳定，体内外活性高，免疫特异性强。这些结果扩大了ADC可用于靶向给药的药物种类。

最近，Agensys公司通过调节中心亚基P2-P3-P4，将叠氮化物基团引入P2和P4亚基，在与蛋白酶可裂解的连接子偶联后，产生了在体外和体内效力提高的亲水性衍生物，这为连接子的连接提供了新途径。

一般来说，在同时含有胺和醇反应的auristatin中，首选的连接点是胺通过氨基甲酸酯键偶联。西雅图遗传学开发了一种新的策略，将含醇的有效载荷与亚甲基烷氧基氨基甲酸酯（MAC）偶联。为了稳定MAC键，碱性基团和吸电子基团都靠近氨基键，结果表明，该偶联物在生理条件下是稳定的，具有很高的效价，并且在体内外都具有免疫特异性。

此外，乌普萨拉大学的研究人员还开发了AZASTATIN，作为一类新的强有力的auristatin衍生物，包含一个中心胺侧链的抗体结合位点。他们的研究结果证实，这些auristatin衍生物是一类新的细胞毒性有效载荷，适合ADC开发。

美登素衍生物（DM2，DM4）

美坦辛是一种非常有效的微管组装抑制剂，可诱导细胞的有丝分裂停止。但是这种结构很难共轭，因为它没有反应性官能团，为了克服这个问题，一系列含有SMe基团的非常有效的衍生物被创造出来。这一类分子的第一个例子是DM1和DM4，它们带有甲硫丙酰基而不是天然N-乙酰基。

从有效载荷DM1和DM4中，通过使用二硫键与连接子偶联。稳定的二硫键连接子在血液循环中表现出良好的稳定性，同时在细胞内保持有效的分裂。

此外，几种基于maytansine的ADC利用相同的二级羟基作为附着点，并在大多数情况下携带转谷氨酰胺酶生物结合的连接子。例如，一种基于Daratumumab的ADC被证明能向CD38过度表达的癌细胞特异性地传递DM4。最近ImmunoGen开发了一种新型的ADC，它包含一种含硫的maytansinoid，通过一种高度稳定的三肽连接体连接到抗体上，附着点与上述羟基相同。与先前的美登素ADC相比，增加连接物中亚甲基单元的数量增加了旁观者杀伤活性，并提高了小鼠体内的疗效。在类似的方法中，保持核心大环不变，Regeneron和Abzena的研究人员研究了N-甲基丙氨酸氮取代的影响，也改变了大环上侧链的长度，以及通过伯胺和仲胺连接的连接子。

微管溶素

Tubulysins是微管聚合的有效抑制剂，可导致分裂细胞的细胞骨架迅速解体，并导致细胞凋亡。它们是一个天然存在的四肽家族，含有Mep、Ile、Tuv和Tut，R3=OH或Tup，R3=H。

利用Tubulysins作为ADC有效载荷，其广泛的附着点已被充分开发。这种结构中一个明显的附着点是Tut或Tup模块的羧酸，如Endocyte的EC1428，其中羧酸通过酰肼部分连接到连接子。Oncomatryx公司也采用了同样的方法，以同样的方式安装了可切割的PABAValCit马来酰亚胺连接子。

阿斯利康、百时美施贵宝和辉瑞使用的另一种方法依赖于Tup或Tut中苯环的衍生化。

连接子与Mep基团的连接也得到了广泛的研究。Ingenica研究人员报告说，去甲基Mep类似物保留了强大的细胞毒性活性，可被视为有价值的有效载荷，允许在仲胺上引入不可切割的马来酰亚胺己基连接子。

Oncomatryx的研究表明，当Mep被另一个拥有仲胺的基序取代时，通过氨基甲酸酯键引入可切割的连接体是产生ADC的有效途径。特别有趣的是，基因泰克关于通过季铵基团将连接子连接到含叔胺的有效载荷上。在有效载荷上引入mc-Val-Cit-PABA连接子导致更多亲水性结合物并改善了血液中的稳定性。西雅图遗传学也采用了同样的方法，通过过度表达葡萄糖醛酸，葡萄糖醛酸连接子也可以改善亲水性和选择性的细胞内切割通过癌细胞中过表达的β-葡萄糖醛酸酶。

隐粘菌素

隐粘菌素（Cryptomycins，CR）是一个具有抗肿瘤活性的六元大环二肽家族。已有的临床试验的结果表明，在达到治疗效果所需的剂量下，其毒性水平是不可接受的。

几个小组尝试将CR用于ADC，但是由于在CR中缺少偶联位点，目前，有两种不同的方法通过引入其它基团，使得能够连接ADC的连接子。一种是由基因泰克的研究人员将苯转化为苄胺以产生有效的有效载荷，这种有效载荷适合通过氨基甲酸酯键连接。在第二种方法中，四川大学的研究人员利用了隐霉素-52的前药形式（CR55），它可以在生理条件下重新环化为CR52。

抗有丝分裂EG5抑制剂

纺锤体驱动蛋白（KSP，也称为Eg5或KIF11）是一种ATP依赖性运动蛋白，参与细胞周期中心体的分离。因此，用KSP抑制剂（KSPis）阻断有丝分裂中的这一重要事件可产生抗肿瘤效力。

拜耳发现了一个新的吡咯亚类的KSPis，他们研究了该分子不同位置与保持对KSP强亲和力的连接子的连接兼容性。

同样，诺华的研 究人员使用含咪唑的KSP抑制剂作为Eg5 ADC。利用伯醇或仲酰胺部分，他们安装了带有马来酰 亚胺端基的不可裂解连接子。当与靶向HER2和c-KIT的抗体偶联时，得到的ADC显示出优于Kadcyla的体内疗效。

2.DNA损伤药物

吡咯苯并氮卓类和吲哚氯苯并氮卓类

吡咯并[2,1-c][1,4]苯二氮杂卓（PBD）是一类具有抗肿瘤活性的天然产物。它们的作用方式是在DNA的小凹槽中进行选择性烷基化，其中鸟嘌呤的N2与PBD上的亲电N10/C11亚胺形成共价键。

西雅图遗传学使用SGD1882的苯胺作为附着点，模仿可切割连接子中常用的PAB单元，释放自由的PBD有效载荷。StemCentrx与Spirogen合作，利用PBD的N-10位置连接一个氨基甲酸酯的连接子。同样的氨基甲酸酯键也被Immunogen用于结构相似的吲哚氯苯偶氮卓二聚体（IBD）有效载荷。他们还报道了同一类IBD的不同方法，其中一个取代的苯环被用作两个IBD单体的C8/C8'位置之间的连接物。

以类似的方法，Spirogen和Genentech设计了一种碘苯连接的PBD，允许在过渡金属催化反应中引入不同的连接子。通过使用Sonogashira偶联、Buchwald–Hartwig偶联或叠氮化物-炔烃点击反应，分别获得炔烃、哌嗪或三唑连接的连接子有效载荷共轭物。

杜卡霉素

杜卡霉素是一种强大的细胞毒性物质，通过其高活性的环丙烷环与DNA的小凹槽结合，并在N3位置烷基化腺嘌呤。非环化的，卤甲基形式的杜卡霉素细胞毒性活性显著降低。由于分子中苯酚基团可作为内消旋体激活剂，从而形成亲电环丙烷，因此杜卡霉素ADC开发中的连接策略集中于酚官能团的连接子连接。

在Synthon开发的SYD985中，苯酚基团是通过双氨基甲酸酯连接连接子与Mc-val-cit-PABC有效载荷的位置。组织蛋白酶B裂解后，游离苯酚促进分子内重排成亲电环丙基形式。Medarex采用了一种不同的方法，通过分子非烷基化部分的芳香胺连接连接子，并用N-甲基哌嗪氨基甲酸酯部分掩蔽苯酚前药。在体内，苯酚将被释放，随后活性环丙烷将在羧酸酯酶的作用下形成。

喜树碱

喜树碱（CPT）及其衍生物是拓扑异构酶I抑制剂的经典例子。它们稳定了拓扑异构酶诱导的DNA单链断裂，当三元DNA-TOP1-抑制剂复合物遇到复制叉时，DNA发生双链断裂。天然喜树碱是一种五环结构，其极低的溶解性阻止了其作为癌症治疗药物的广泛应用。其水溶性前药伊立替康获得了转移性结直肠癌的上市许可。SN-38是伊立新坦的活性代谢物，通过人体肝脏羧酸酯酶的作用在体内生成，其可通过打开内酯环而失活。

Immunomedics建立了两种不同的策略，通过其羟基部分结合SN-38。在一个例子中，连接子通过反应性更强的C-10苯酚基团连接，从而产生稳定的氨基甲酸酯键，而在另一个例子中，通过C-20羟基，同时稳定内酯形式，而C-20羟基对体内效力至关重要。

另一种适合ADC的非常有效的药物是依沙替康（DDX-8951f）。这种喜树碱类似物在其环己烷环上具有胺取代基，桥接7和9位。依沙替康的氨基有助于其水溶性，而环己烷环赋予的刚性被认为有利于活性内酯形式与非活性水解羟基酸的平衡。氨基羟基乙酰化生成DXd（1），而4-氨基丁酰化生成DXd（2），这两种化合物都保留了依沙替康的生物活性。

悬垂的羟基和氨基是明显的附着点，可使用酶可切割的Gly-Gly-Phe-Gly四肽连接子连接有效载荷。与抗HER2抗体偶联产生的ADC在临床环境中显示出对抗HER2表达癌症的巨大潜力。

DXd的环己胺环虽然被认为稳定了生物活性内酯形式，但它携带了一个手性中心，使合成工作和SAR研究复杂化。为了克服这一困难，Immunogen的研究人员研究了一组新的喜树碱类似物，这些类似物能够与单抗偶联。并且在这里，这个环被打开，额外的手性中心被消除。从一种常见的中间产物开始，研究人员尝试了三种类型的结构，并随后使用不同的聚苯胺连接子连接有效载荷。当与抗人表皮生长因子受体（HuEGFR）的抗体偶联时，产生的ADC对EGFR阳性的HSC-2肿瘤异种移植模型有效。

卡奇霉素

卡奇霉素是一类被广泛研究的烯二炔类抗生素，其结构和作用机制特别有趣和复杂，使其成为ADC有效载荷领域的一类抗生素。在ADC中连接calicheamicin的策略以市场上的adc Mylotarg为例，还有Besponsa。

有效载荷的释放分两步进行：在酸性细胞内环境中对腙进行敏感的裂解，然后通过细胞内谷胱甘肽还原二硫键。释放的硫醇发生分子内1，4-加成的烯酮触发伯格曼环化反应，产生一个二自由基。这种活性中间体能够从脱氧核糖骨架中提取氢原子，产生双链DNA断裂，进而导致细胞死亡。

最近，从不列颠哥伦比亚地衣中发现的链霉菌中分离出一种新的烯二炔类天然产物，称为uncialamycin。这种结构通过全合成得到证实，从那时起，一些高效的合成类似物被制备成ADC的潜在有效载荷。

BMS的研究人员表明，由于在各种肽偶联条件下反应活性较低，因此，Uncialamycin的仲胺不是一个合适的连接点。研究人员合成了一种类似物，其中一个氨基直接引入到芳香环上，但这种苯胺的反应性也太弱，不能作为连接子引入的基团。另一方面，使用氨基乙基延伸物安装脂肪族胺，为连接子提供了合适的连接点。

从后一个有效载荷中，他们使用蛋白酶可切割的二肽和不可切割的连接子制备前体。CD70-ADC具有可切割连接体，对肾癌细胞株具有高度特异性的细胞毒活性，而相应的不可切割ADC在同一细胞株上不具有活性。

最近，为了继续这项工作，BMS的研究人员在设计的、高效的、化学稳定的uncialamycin类似物中使用苯酚基作为附着点。使用新开发的苯酚烷基化，在有效载荷的苯酚基团上添加了一个经典的可裂解连接子。将产生的有效载荷与抗体偶联，其在体外和体内均显示抗原特异性抗肿瘤活性。

3. 创新药物

凋亡诱导剂（Bcl-xL抑制剂）

抗凋亡Bcl-2家族成员（包括Bcl-xL）的过度表达是癌细胞获得凋亡抵抗的机制之一。能够阻断Bcl-xL上BH3结合域的药物可以触发癌细胞凋亡。2017年，AbbVie首次以ADC的形式展示了BcL-xL抑制剂的有效载荷，其靶向表达EGFR的特定细胞或组织。有趣的是，研究人员在有效载荷上使用了三个不同的连接点来连接可切割的连接子。氨基烷基延伸的核心修饰用于在需要时建立合适的连接位点。

泰兰司他丁及其类似物

靶向剪接体是一种参与mRNA加工的大型核糖核蛋白复合物，为靶向癌症治疗提供了一种有希望的治疗选择。有几种天然产物能够通过与不同的剪接体亚单位结合来抑制RNA剪接。最具代表性的是thailanstatin A，它可以与剪接体的SF3b亚单位结合，从而阻止RNA剪接。

Thailanstatin A缺乏一个适合连接连接子的基团。为了解决这个问题，将羧酸与乙二胺偶联以引入含有胺的间隔基，该间隔基通常用于连接子的安装。

将这种天然产物用于ADC的另一个困难是存在多种反应性功能。例如，中心核中的二烯可以通过Diels–Alder反应与用于生物结合的马来酰亚胺部分反应。这个问题是通过使用另一个共轭部分，卤代乙酰胺来解决的。结合这两种修饰并包含可切割连接子的ADC首次在专利文献中报道，并且声称它们在几个表达HER2的细胞系中具有适度的活性。

最近，辉瑞报告说，羧酸直接与抗体的有效表面赖氨酸（无连接子偶联）结合导致迄今为止最有效的Thailanstatin ADC。这些赖氨酸偶联物的活性与药物负载有关，而其他有效载荷类通常没有观察到这种特性。ADCs在胃癌异种移植模型中显示出良好的作用。

鹅膏毒素

在ADC技术领域，使用类似amatoxins的转录抑制剂是一种相对较新的方法。九种天然存在的amatoxin衍生物具有相同的骨架结构，一个由八个L-构型氨基酸组成的大环，通过亚砜部分连接在色氨酸和半胱氨酸残基之间。amatoxins的三个侧链是羟基化的，OH基团具有良好的水溶性并与目标分子结合。两种肽，α-鹅膏糖蛋白和β-鹅膏毒素，占所有毒素的90%。

在amatoxins上共使用过三个附着点产生ADC。第一次尝试是将β-鹅膏毒素的羧基偶联到IgG上赖氨酸的氨基，这种连接具有良好的血浆稳定性和高细胞毒性，但这种生物偶联的产率很低。二氢异亮氨酸的羟基也被认为是一个连接点，引入谷胱甘肽作为连接子，然后通过赖氨酸结合，可获得体外细胞毒性和体内抗肿瘤活性优异的ADC，但不幸的是，由于血清羧酸酯酶裂解连接子，导致其循环稳定性差。第三种方法，附着于色氨酸的6-羟基代表了目前的标准程序，苯酚与各种连接子的醚化导致了高度稳定和有效的ADC。由于鹅膏毒素其它氨基酸要么不具化学活性，要么是与RNA聚合酶II结合的关键，因此不能将其它的鹅膏毒素氨基酸（即羟脯氨酸、甘氨酸、异亮氨酸和半胱氨酸）用于偶联。

基于amanitin的代表性的ADC为HDP-101。有效载荷本身是一种合成的金刚烷醇衍生物，优化了稳定性。与天然天麻素相比，两个差异是色氨酸中没有6′-OH，硫醚链取代亚砜。通过天冬氨酸侧链上酰胺的形成，引入组织蛋白酶B-裂解连接子。

最近，Park及其合作者为含苯酚的有效载荷设计了一种新的连接基序（OHPAS）。它是一种二芳基硫酸盐，一个芳基部分来自有效载荷，另一个来自连接基序的潜在苯酚基团。将该技术应用于曲妥珠单抗ADC中的a-鹅膏毒素，在体外和体内表现出强大的细胞毒性。

烟酰胺磷酸核糖转移酶

烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）是一种负责将烟酰胺转化为烟酰胺单核苷酸的酶，其抑制剂在各种临床前和临床研究中显示出有效性，但其临床应用受到靶向毒性和剂量限制性毒性的限制，如血小板减少和胃肠道不良反应。

诺华公司的研究人员在NAMPT抑制剂有效载荷中的苯环对位中引入哌嗪部分，确定了合适的连接子附着点。这种分子在c-Kit和HER2表达细胞系上表现出纳摩尔水平的效力，并且耐受性良好，在体内表现出靶向依赖性。

卡马霉素

从库拉索菌中分离得到两种新的蛋白酶抑制剂，卡马霉素A和卡马霉素B。两者都具有亮氨酸衍生的α,β-环氧酮弹头直接连接到甲硫氨酸亚砜或甲硫氨酸砜。他们被发现能抑制酿酒酵母20S蛋白酶β5亚单位活性（糜蛋白酶样活性）。此外，它们对肺癌和结肠癌细胞株具有很强的细胞毒性。

然而，由于它们的高效价，它们的选择性较差，经常表现出毒副作用。因此，剧毒的卡马霉素衍生物适合作为ADC的弹头，可以保持所需的效力，并获得更好的耐受性。所设计的类似物均在P2位置并入砜甲硫氨酸衍生物（如卡马霉素B），而不是卡马霉素A中的亚砜甲硫氨酸，因为这消除了亚砜基立体异构体混合物产生的结构复杂性。

第一代类似物在P4末端含有胺基，不幸的是，这个附着点并不合适，因为有效载荷显示细胞毒性活性降低。第二代卡马霉素类似物在P2侧链上含有一个胺基，当短乙基氨基链延伸磺酰基时，效果最好。在第三代类似物中，芳基连接砜和胺，因此降低了它的碱性。第二代和第三代有效载荷都显示出强大的体外活性，并用可切割或不可切割的连接子连接。不幸的是，没有一种ADC对受试癌细胞系表现出比曲妥珠单抗更高的细胞杀伤能力。

二、连接子

连接子不仅是抗体与小分子有效载荷之间形成共价连接的分子部分，而且是靶向药物治疗中具有设计性质的关键元件。连接子的加入不应诱导聚集，并且需要确保可接受的PK特性，同时限制有效载荷在血浆中的过早释放（稳定性），并使活性分子在靶向作用位点有效释放。连接子分为两类：不可切割型和可切割型。

1. 不可切割连接子

基于不可切割的连接子的ADC必须被内化，抗体部分需要被溶酶体蛋白酶降解以释放活性分子。在ADC开发过程中已经探索了许多不可切割的连接子，最具代表性的是N-琥珀酰亚胺基-4-（N-马来酰亚胺甲基）环己烷-1-羧酸盐（SMCC），Kadcyla就是使用的此类型连接子。

这种结构的分解代谢导致Lys-SMC-DM1成为主要的肿瘤代谢物。此外，与这种连接子相连的药物通常不能发挥旁观者效应，因为释放的分解代谢产物通透性较差。目前的研究主要集中在可切割的连接子上。

使用可切割连接子对于具内化和不具内化ADC的设计同样可行，因为释放是由切割位点（溶酶体和/或肿瘤环境）的性质触发的。连接子可以分为两大类：酶依赖性和化学（即非酶）依赖性。

2. 化学依赖性连接子

含有二硫键的连接子受到硫醇的亲核攻击以释放活性载荷。尽管血浆中人血清白蛋白（HSA）的还原形式就是最丰富的硫醇，但它对大分子的反应性很差。胞浆中还含有高水平的谷胱甘肽（GSH），这是一种含有巯基的三肽，很容易与S-亲核蛋白发生反应。血液（微摩尔范围）和细胞质（毫摩尔范围）中GSH浓度的差异以及癌细胞引起的氧化应激有助于药物在癌细胞内的优先释放。含有二硫键的连接子主要与maytansinoid类有效载荷相关。二硫键的反应性可由空间位阻调节：α-甲基替换显著影响还原速率和对硫醇-二硫键交换的抗性，如SAR-3419的连接子通过偕二甲基替换获得SPDB-DM4最佳的抗肿瘤活性。

腙连接子显示出依赖于pH的稳定性，在中性pH下稳定，并在酸性介质中水解（内体的pH<6，溶酶体的pH<5），形成相应的酮和肼。

该方法已成功应用于IMMU-110，包含一个可裂解酰基腙连接子，由4-马来酰亚胺甲基环己烷-1-羧酸盐（MCC）的酰肼与阿霉素中存在的酮基反应中形成。

腙连接体也经常用于卡利霉素家族的有效载荷，在这种情况下，释放是由两步活化过程触发的：第一步酸敏感腙被水解，第二步二硫键被GSH还原，使巯基中间体环化。这种连接子已经在上市的Mylotarg和Besponsa中使用，但是它们在血浆中的稳定性不如预期，也不如其他可切割连接子吸引人。

3. 酶依赖性连接子

为了限制有效载荷在内化前的释放，从而防止或最小化目标细胞外的降解，溶酶体的蛋白质组分成为寻找能够降解ADC并以高浓度存在的酶的合理场所。

组织蛋白酶-B

组织蛋白酶B是一种半胱氨酸蛋白酶，存在于哺乳动物的晚期内体和溶酶体中，在许多癌细胞中也过度表达。最初，一种可切割的二肽作为组织蛋白酶B的底物用作阿霉素前药，这项工作建立了SAR的二肽部分：P1位置需要亲水性残基（瓜氨酸或精氨酸），而P2位置的亲脂性残基增强血浆稳定性（苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸）。

此外，还引入了一个自降解间隔子来促进酶的进入，从而限制了有效载荷的空间位阻：对氨基苄基氨基甲酸酯（PABA）在酸性介质中自发1,6-消除，释放二氧化碳、对氮杂醌甲酰胺和阿霉素。最终，这一发现从前药转移到ADC领域，证明了Val-Cit和Phe-Lys二肽连接子的抗原驱动的细胞活性。

Val-Cit二肽是ADCs中最常用的可裂解连接子，目前有多达25个分子处于临床阶段，可能是因为其整体良好的血浆稳定性、释放行为和化学可牵引性。两个已获批的ADC药物（Adcetris和Polivy) 都使用了相同的连接子mc-VC-PABC，其中包含马来酰亚胺基间隔子、作为组织蛋白酶底物的标准Val Cit二肽序列和PABC自降解间隔子。

Val-Ala二肽也被广泛应用，有7个分子处于临床阶段，进展最快的是Loncastuximab tesirine，其包括一个聚乙二醇化间隔子，以平衡属于PBD二聚体家族的有效载荷SG3199的亲脂性。

研究表明，由于沉淀和聚集，Val-Cit很难实现高DAR。相反，Val-Ala连接子允许DAR高达7.4，且聚集有限（<10%）。与Val-Cit相比，Val-Ala的疏水性较低，这解释了为什么这种连接子在亲脂性的有效载荷（如PBD二聚体）方面表现卓越，7个临床候选ADC的Val-Ala连接子都连接PBD。

一些研究将Val-Cit和Val-Ala二肽结构与MMAE的有效载荷连接进行了比较。在非内化抗体的情况下，结合到工程化半胱氨酸的Val-Cit和Val-Ala连接子都表现出类似的特征，并且比Val-Lys和Val-Arg类似物表现出更好的性能。在使用随机半胱氨酸结合的抗Her2 ADC的情况下，与Val-Cit相比，Val-Ala在高DAR结构中显示出较少的聚集性。另一方面，两种连接子显示出相似的缓冲稳定性、组织蛋白酶B释放效率、细胞活性和组织病理学特征。

四肽Gly-Gly-Phe-Gly显示出稳定和有效的可切割连接子的所有特性，已上市的ADC药物Enhertu使用了此类连接子。第一三共的Enhertu是一种血浆稳定的ADC，DAR为7.7，在溶酶体中发生蛋白酶降解，释放DX-8951f，这是一种有效的拓扑异构酶I抑制剂，来源于exatecan。由于连接子不含增溶剂，达到如此高的DAR是非常可观的，因为它与广泛确立的原理相矛盾，即高DAR结合物可能具有较差的药代动力学特征。这里使用的自降解间隔子是简单和紧凑的半胺化，而不是Val-Cit连接子使用的PABC。

磷酸酶和焦磷酸酶

与组织蛋白酶一样，焦磷酸酶和磷酸酶也是在溶酶体中选择性表达的水解酶。2016年，默克公司的研究人员设计了含有磷酸和焦磷酸的连接子与组织蛋白酶B敏感的Val-Cit-PABA搭配，旨在传递糖皮质激素：磷酸盐/焦磷酸盐部分结合在自降解间隔子PABA和有效载荷之间。内化后，有效载荷可通过组织蛋白酶B、自降解间隔子和磷酸酶（n=1）的顺序释放。对于焦磷酸酯（n=2），可能需要另一个涉及焦磷酸酶的步骤。

这种亲水性和永久性带电基团的优点是溶解性，不仅能够与亲脂性糖皮质激素衍生物进行生物偶联，而且促进ADC纯化， ADC中的残余连接子少于0.10%。含有磷酸和焦磷酸的ADC在体外都具有活性。

默克公司的同一组研究人员还开发了一种独特的基于焦磷酸酶的连接子，用于释放含羟基有效载荷地塞米松和丙酸氟替卡松。

此外，羟基附着点的性质对有效释放至关重要。地塞米松的伯醇效果良好，而更受阻的氟替卡松的仲醇需要一个缩醛间隔子，从而实现可接受的释放。两种ADC在体外均表现出良好的稳定性，对肿瘤细胞系具有较强的活性。

β-葡萄糖醛酸酶

β-葡萄糖醛酸酶是一类糖苷酶，催化β-葡萄糖醛酸残基的水解，它在溶酶体和肿瘤间质中高表达。西雅图遗传学的研究人员于2006年发表了一项开创性的工作，抗CD70 ADC使用了含葡萄糖醛酸的连接子，葡萄糖醛酸附着在自降解间隔子上。这种连接子表现出低水平的聚集、高血浆稳定性、以及强大的体内功效。

该连接子还通过一个额外的二甲基乙二胺（DMED）自降解间隔子应用于其他含胺的有效载荷，如喜树碱类似物、SN38、杜卡霉素和苦参碱。释放顺序从水解β-葡萄糖醛酸到自降解间隔子，DMED的另一个环化反应自发发生，形成1,3-二甲基咪唑啉-2-酮，并最终释放含羟基药物。由于连接子的亲水性，与组织蛋白酶敏感连接子相比，该技术使ADC的DAR=8制备更为容易。

β-半乳糖苷酶

最近报道了一种使用β-半乳糖苷酶裂解连接子的ADC，其中包含PEG10间隔子。间隔子被硝基取代，以提高自降解速率。类比β-葡萄糖醛酸酶连接子，其解离机制涉及水解β-半乳糖苷酶部分，它赋予化学前体亲水性。另一个优势是β-半乳糖苷酶仅存在于溶酶体中，而β-葡萄糖醛酸酶在溶酶体中表达，也在实体瘤的微环境中表达。研究证明，在抗HER2-ADCs释放MMAE的背景下，含β-半乳糖苷酶连接子的 ADC在体外和体内均比T-DM1更为有效。

硫酸酯酶

最近，出现了硫酸酯酶裂解的连接子，硫酸酯酶在几种癌症类型中过度表达，表现出潜在的选择性。研究涉及以MMAE为有效载荷的抗Her2抗体，与经典的可切割Val-Cit和Val-Ala连接子相比，硫酸酯酶连接子对Her2+细胞系显示出相似的效力。

此外，靶向VEGF可以进一步设计成联合靶向肿瘤细胞上的PD-L1或T细胞上的PD-1，从而将抗血管生成与肿瘤免疫学方法联系起来。例如靶向PD1和VEGF的ivonescimab（AK112），其目前已在中国获批用于。其他bsAbs靶向PDL1和VEGF，包括PM8002，该药物正在NSCLC患者的II/III期研究（NCT05756972）中进行评估。

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三、生物偶联技术

1.基于化学的特异性原位抗体修饰

单克隆抗体的天然结构为生物偶联提供了多种可能性，基于化学的、特异性的天然（非工程）抗体偶联具有一些优点。它可以避免抗体特定位点突变的复杂性，以及在细胞培养的放大和优化方面可能面临的挑战。

偶联位点根据抗体序列，赖氨酸、组氨酸、酪氨酸和半胱氨酸等内源性氨基酸在二硫键间的连接位点非常具有吸引力。所有经FDA批准的ADC，直到2021年，都利用这些内源性氨基酸进行偶联。然而，抗体支架还包含聚糖，这是在单克隆抗体生产过程中，FC区域的翻译后修饰所导致的。一些研究报告了糖工程化的新策略，这似乎是一种有趣的生物偶联替代方法。

与内源性氨基酸的偶联

最常见的偶联方法之一是利用抗体的赖氨酸残基，氨基酸亲核NH2基团与利克有效载荷上亲电的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）基团发生反应。尽管反应简单，但可利用赖氨酸残基的高丰度导致了许多ADC在随机分布下的不均匀混合物的形成。DAR受药物/抗体化学计量比的控制，该方法得到广泛应用，包括已获批的ADC，如Besponsa, Mylotarg, 和Kadcyla。

最近，同样也报道了对赖氨酸位点和残基的特异性修饰。通过计算机辅助设计，磺酰丙烯酸酯被用作中间试剂，用于在天然蛋白质序列上对单个赖氨酸残基进行修饰。

反应的区域选择性归咎于磺酰丙烯酸酯的设计以及每个赖氨酸周围独特的局部微环境。通过计算预测，pKa最低的赖氨酸容易以位点特异性的方式在弱碱性pH下优先反应。即使在其他亲核残基如半胱氨酸存在的情况下也观察到了这种反应。该技术已应用于5种不同的蛋白质和曲妥珠单抗，在偶联后均保留了原有的二级结构和蛋白质功能。

2018年，Rai等人报告了另一种利用“化学关键蛋白”的可逆分子间反应进行的位点特异性修饰。该试剂携带多种官能团，这些官能团在所有可获得的赖氨酸残基上可逆地形成亚胺部分。然后，关键蛋白通过试剂中的环氧化物与近端组氨酸残基反应。因此，在生理条件下，关键蛋白从赖氨酸中分离，醛被再生，从而能够通过肟结合标记抗体。

这种关键蛋白的定向修饰技术后来发展成单赖氨酸残基标记技术，即使在存在N-末端胺的情况下也具有毋庸置疑的选择性。方法的成功依赖于Fk1-间隔子-Fk2试剂。

Fk1官能团与赖氨酸可逆反应，调节Fk2近端赖氨酸部分的微环境。然后通过酰胺键在Fk2处的赖氨酸残基（K169和K395）进行偶联，间隔子的设计调节偶联的位置。该方法已成功应用于ADC（trastuzumab-emtansine）的合成，证明其细胞活性与已获批准的Kadcyla相当。

Merlul等人最近报道了一种不同的结合策略，有效地靶向天然抗体上的组氨酸残基。他们引入了一种基于阳离子有机金属铂（II）的连接子，[乙二胺铂（II）]2+，图中表示为Lx。

这种技术基于络合和偶联两个步骤。氮杂环配体如哌啶与Lx配位形成络合物前体，稳定的中间体包含有效载荷和配体上的一个氯离子。该复合物含有带正电荷的Pt（II）中心，这提高了连接子和有效载荷复合物的水溶性并最小化抗体聚集，该方法还扩展到类似的碘络合物。在最近的一份报告中，碘化钠的使用被证明可以显著提高该技术的偶联产率和选择性。Cl-Lx-药物载荷络合物上残留的氯配基与碘化物的交换生成更具活性的I-Lx-药物载荷，从而获得更高的偶联产率。这项技术已被应用于ADC药物的大规模生产。

二硫化物重桥接策略

IgG抗体包含四个链间二硫键，两个连接轻链和重链，两个位于连接两条重链的铰链区，它们维持着单克隆抗体的完整性。另一个经典的生物偶联途径探索了这些半胱氨酸作为有效载荷连接点的作用。四个二硫键的还原通常会产生八个巯基，它们能够与马来酰亚胺的连接子反应，从而产生DAR为8的ADC。

Doronina及其同事报告了嵌合抗CD30单克隆抗体偶联MMAE，DAR=8的 ADC实例。与经典的赖氨酸偶联相比，这种有效载荷加载方式得到了更好的控制。然而，据报道，较高的药物负荷会增加聚集的风险，从而导致高血浆清除率，并降低体内疗效。

Badescu和al在2014年报告了一种新的位点特异性重桥接偶联策略，他们是第一个证明新的双砜（bis-sulfone）能够烷基化来自抗体和抗体片段中还原二硫键的两个巯基，对抗原结合的影响最小。后来，Wang和al描述了一种新的水溶性烯丙砜（allyl sulfone），该试剂在没有原位活化的情况下提高了反应活性。它表现出高稳定性、高水溶性和位点特异性。

此外，还有巯基炔与末端炔烃和环辛炔生物偶联的再桥接技术，其进一步发展出新一代马来酰亚胺，如二溴-（DBM）和二硫代马来酰亚胺（DTM），用于位点特异性偶联。这些马来酰亚胺类似物在第3位和第4位含有良好的脱离基团，从而实现快速、高效和高产率的偶联。最近报道了结合二溴和二硫代马来酰亚胺性质的杂化硫代溴马来酰亚胺（TBM），这种TBM试剂结合更快，显示出更高的DAR=4的百分比，这可能是由于溴减少了空间位阻。

2015年，Chudasama等人引入了一类新的重桥接试剂，二溴吡啶二酮（dibromopyridazinediones）。他们证明了它能有效地插入到二硫键中，得到的结构即使在高温下也表现出了极好的水解稳定性。然而，随着还原步骤上的温度升高，也观察到不均一性，这种结构也允许选择性地引入不同的功能基团。

二乙烯基嘧啶（Divinylpyrimidine）是另一种有效的重桥接试剂，能够产生稳定的DAR=4的ADC。Spring等人研究了乙烯基杂芳基支架对半胱氨酸再桥接的作用，他们认为用嘧啶取代吡啶可以使杂芳环成为更好的电子受体，从而提高交联效率。他们的工作扩展到二乙烯基三嗪，在高温下，重桥接显示出更高的效率。

为了避免与经典马来酰亚胺偶联相关的体内不稳定性的缺点，Barbas等人研究了甲基磺酰基苯基恶二唑，该试剂对半胱氨酸具有特异性反应。与血浆中的半胱氨酸-马来酰亚胺偶联物相比，他们的稳定性更高。受此启发，Zeglis设计了DiPODS试剂，该试剂含有两个通过苯基连接的恶二唑基甲基砜部分， DiPODS以重桥接的方式与两个硫酸根形成共价键。与马来酰亚胺偶联相比，以这种方式偶联具有优越的体外稳定性和体内性能。

聚糖偶联

由于IgG是一种糖蛋白，它在Fc片段每个重链的CH2结构域N297位置包含一个N-聚糖，这种糖基化可以作为连接有效载荷的附着点。多糖与Fab区域间远距离定位降低了在偶联后损害抗体的抗原结合能力的风险，此外，与抗体的肽链相比，它们的化学组成不同，允许位点特异性修饰，使它们成为合适的偶联位点。

聚糖生物偶联可根据用于靶向碳水化合物的技术来区分：包括聚糖代谢工程化、聚糖氧化后的糖转移酶处理、内糖苷酶和转移酶处理后的酮或叠氮化物标记。

Neri等人报道了在IgG抗体的N-糖基化位点处岩藻糖的位点特异性修饰。这种糖含有一个顺式二醇部分，适合选择性氧化。他们用偏高碘酸钠氧化岩藻糖残基，生成一个能够与含联氨的连接子反应的醛基，这样，抗体通过腙键与药物相连。

Senter及其同事向细胞培养基中添加硫基类似物，通过代谢将6-硫代岩藻糖带入抗体修饰。他们认为，取代是通过劫持岩藻糖基化途径来完成的，这样就引入了化学位点来实现位点特异性结合。与经典半胱氨酸偶联物相比，这种方法显著降低了异质性水平，并产生具有更可预测的药动学和药效学特性的偶联物。

重组IgG中很少含有唾液酸，然而，已经证明，利用半乳糖基和唾液酸转移酶可以酶法改造甘氨酸。通过酶反应添加半乳糖以获得G2聚糖，然后添加末端唾液酸。这种修饰通过高碘酸氧化生成醛基，可以偶联带羟胺基团的连接子-有效载荷。所得的偶联物具有较高的靶向选择性，体内抗肿瘤活性良好。高碘酸还可氧化蛋氨酸等敏感氨基酸，影响与FcRn的结合。

除这些偶联策略外，半乳糖残基也可以作为修饰位点。多项研究报告了通过使用突变的β- 1，4-半乳糖转移酶，将半乳糖替换为一种含酮或叠氮官能团的半乳糖，这种具有双正交官能团的半乳糖衍生物为高效偶联开辟了途径。这些技术已被开发用于成像和抗癌应用。

从化脓性链球菌中发现的内糖苷酶EndoS和EndoS2，这些酶能够水解IgG的N-聚糖，从而使水解后的残基成为生物偶联的有效位点。这种方法有助于使单抗的聚糖结构均匀化，同时它也适用于任何IgG亚型。此类方法应用于trastuzumab-maytansine，制备出具有良好体外和体内药效的糖偶联ADC。

2. 工程化抗体的位点特异性生物偶联

生物正交化学和蛋白质工程领域的进展有助于产生更均匀的ADC。尽管在天然单抗上有许多可用的附着方法可供选择，但在工程化抗体上的位点特异性生物偶联能够更有效地控制DAR，并且避免改变与抗原结合的亲和力。这样，在某些位置加入天然或非天然氨基酸，得到具有优良药代动力学和药效学特征的同质产品。

酶法

有效载荷的附着可以通过在抗体序列中插入特定的氨基酸标签以非常有选择性的方式实现。这些标签被特定的酶所识别，例如甲酰甘氨酸生成酶（FGE）、微生物谷氨酰胺转胺酶（MTG）、转肽酶或酪氨酸酶，从而能够执行位点特异性偶联。

Aaron等人探索了一种新的利用醛标记蛋白质的位点特异性偶联。该技术利用了基因编码的五肽序列（Cys-X-Pro-X-Arg），其中半胱氨酸残基被FGE识别，并在细胞中蛋白质表达期间被共翻译氧化为甲酰甘氨酸。这样，工程化抗体通过HIPS（hydrazino-Pictet–Spengler）化学方法与醛特异性连接子选择性偶联。

微生物转谷氨酰胺酶（MTGase）策略也经常被开发用于定位特异性偶联。MTGase催化在脱糖抗体295位置的谷氨酰胺侧链与底物的伯胺之间形成肽键。与其他酶策略相比，MTG是一种灵活的技术，不需要肽供体来实现偶联。只要酰基受体含有一种伯胺，就没有结构限制。

谷氨酰胺残基自然存在于单抗的每个重链的Fc区域。在295位去糖基化后，谷氨酰胺残基通过MTGase介导的反应偶联，可以产生均一的DAR=2的ADC。为了提高效率，可以偶联带支链的连接子，从而使DAR翻倍，297位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺也可增加DAR。

NBE Therapeutics开发了基于S金黄色葡萄球菌转肽酶A介导的偶联。他们的策略利用转肽酶A（SrtA），在LPXTG（X=任何氨基酸）五肽的基序中切割苏氨酸和甘氨酸残基之间的酰胺键。然后，它催化甘氨酸相关的有效载荷与新生成的C-末端的偶联，在生理温度和pH下生成肽键。

该方法应用于不同抗体，如抗CD30和抗Her2，并使用含有5甘氨酸标记的连接子偶联maytansine和MMAE，两种ADC均显示出与经典偶联相似的体外细胞杀伤活性。酶法产生的trastuzumab-maytansine在体内试验中完全匹配Kadcyla。

在另一个例子中，利用转肽酶法生成了高效蒽环素毒素衍生物PNU-159682的ADC。有趣的是，通过这项技术，偶联效率甚至高于Adcetris和Kadcyla类似物。此外，所制备的PNU-159682 ADC具有较高的体外和体内稳定性，并且显示出的效力超过了含有微管蛋白靶向有效载荷的ADC。

另一个新兴的新方法是通过酪氨酸标签进行位点特异性抗体标记，酪氨酸标签与单克隆抗体轻链的C末端基因融合。考虑到位点可及性，Bruins及其同事使用了一种工程化的四甘氨酰酪氨酸残基作为标记，它为偶联提供了一个容易触及的位点。酪氨酸酶将酪氨酸氧化成1,2-醌，从而允许与各种双环[6.1.0]壬炔（BCN）衍生物的环加成反应。这种方法可以与含有BCN连接子的MMAE有效地偶联。

半胱氨酸工程：硫单抗技术

随机半胱氨酸偶联和重桥接是利用抗体结构内天然存在的半胱氨酸残基的技术。然而，随机半胱氨酸方法的异质性以及重桥接策略中的单抗片段化需要在ADC合成中加以考虑，特别是当疏水性药物被偶联时。

与它们不同的是，硫单抗技术通过利用不涉及结构二硫键的工程化反应性半胱氨酸，在抗体上实现所需位点的选择性和均匀修饰。一般来说，半胱氨酸突变的设计是为了促进细胞毒性有效载荷偶联的同时，保持单克隆抗体的稳定性、亲和力和最小化ADC聚集。为了确定突变的最佳位置，通常采用几种技术，包括计算建模、模型系统筛选和高通量扫描。

Junutula等人首先报道了一种硫单抗策略，用工程化半胱氨酸残基取代了抗MUC16抗体重链114位的丙氨酸（HC-A114），工程化位置内的反应性硫醇能够与马来酰亚胺负载的连接子反应。合成的抗MUC16 ADC在异种移植小鼠模型中表现出效力，在大鼠和食蟹猴中表现出高剂量耐受性，这个发现建立了硫单抗偶联策略的一般性方法。

此外，琥珀酰亚胺连接在胞浆内可以经历两个平行反应：反向Michael反应导致连接子-有效载荷的损失，以及琥珀酰亚胺的水解，这两种反应都对体内ADC活性有显著影响。为了提高稳定性，Lyon和合作者设计了一个与马来酰亚胺相邻的碱性氨基整合进来的连接子。在连接子中加入二氨基丙酸（DPR）促进了硫琥珀酰亚胺在中性pH和室温下的快速定量水解，这样，非特异性的去偶联作用被阻止，从而提高了体内的稳定性。除了常用的马来酰亚胺外，还探索了不同的半胱氨酸反应剂，如碘乙酰胺、溴甲酰胺、羰基丙烯酸酯，N-烷基乙烯基吡啶盐。

3. 与工程化非天然氨基酸的生物偶联

除了硫单抗技术外，非标准氨基酸（ncAA）的加入为位点特异性偶联提供了另一种可能性。该技术使用含有独特化学结构的氨基酸，从而能够以化学选择性的方式引入连接子-有效载荷复合物。该技术需要对抗体序列重组，利用与宿主细胞内所有内源性tRNAs和合成酶正交的tRNA和氨基酰tRNA合成酶（aaRS），用于响应未赋值密码子将ncAA带入蛋白质。通常，ncAA在发酵过程中被添加到培养基中。选择非天然氨基酸是很重要的，因为它们可能激发免疫原性。常用的ncAA是具有独特基团的天然氨基酸的类似物，如酮、叠氮、环丙烯或二烯。

已有研究将对乙酰苯丙氨酸（pAcF）成功地整合入抗CXCR4 抗体中。有效载荷Auristin通过肟连接与抗体有效偶联，从而生成化学均一的ADC。该ADC在小鼠体内表现出良好的体外活性和完全清除肺肿瘤的作用。

由于肟连接所需的酸性条件和ADC缓慢释放的动力学，另一种选择是加入含ncAA的叠氮化物。广泛应用的对叠氮哌苯胺（pAzF）可在生理条件下快速进行CuAAC或SPAAC反应，利用这种策略成功地在抗CD74抗体上偶联糖皮质激素有效载荷。除了pAcF技术外，还成功地将含叠氮的赖氨酸类似物（AzK）带入到抗体中，以产生具有Auristin、PBD二聚体或微管蛋白有效载荷的位点特异性ADC。

此外，赖氨酸的环丙烯衍生物（CypK）以及自然发生的非典型氨基酸，如硒代半胱氨酸（Sec）都成功地整合进入抗体中。所产生的ADC表现出良好的稳定性、选择性以及体外和体内活性。

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四、ADC靶向抗原的内吞特性

CD33

CD33是一种67kda跨膜糖蛋白受体，通常在正常髓系细胞上表达，由于其在AML细胞上优先过表达，是GO的靶点。CD33的胞内免疫受体酪氨酸基抑制基序（ITIM）调节CD33的内吞作用，可通过CME激活内吞作用。关于内吞效率，AML细胞中CD33的表达水平与其内吞率之间没有相关性。CD33是一种缓慢内化的抗原，此外，CD33交联并不能改善内吞作用。对GO无响应的AML患者可能与CD33受体内吞的功能低下有关。

CD30

CD30是一种120kda跨膜糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）超家族。其细胞外部分由六个扩展构象的富含半胱氨酸的结构域（CRD）组成。CD30在活化的T细胞和B细胞以及各种淋巴肿瘤（包括霍奇金淋巴瘤和ALCL）上表达。

CD30不具有内吞作用，相反，它因蛋白水解裂解而脱落，CD30的脱落由基质金属蛋白酶（MMPs）介导。脱落是CD30生物学的一个特征，高浓度的循环可溶性CD30可以作为监测肿瘤进展的血清标志物。对于ADC的疗效，升高的CD30循环水平似乎会隔离注射的ADC，从而减少能够定位于CD30阳性肿瘤部位的ADC的数量。因此，缺乏内吞作用的结果表明CD30不是理想的ADC靶点。

CD22

CD22是一种140 kDa的跨膜糖蛋白，与CD33一样，它也是Siglec家族的成员，并与该家族共享多种结构特征。关键的区别在于CD22比CD33大得多，因为它有多个Ig结构域和ITIM/ITIM样基序。CD22的表达仅限于B细胞，CD22在各种B细胞恶性肿瘤（包括ALL）的大多数母细胞中表达水平升高。

CD22通过CME进行内吞作用。类天然配体通过CD22的结构性快速内吞在细胞内积聚。这些配体在溶酶体中被分类降解，而CD22则循环回到细胞表面。此外，CD22配体诱导的内吞激活细胞内池，补充或增加细胞表面CD22的表达水平。因此，CD22对ADC具有良好的内吞特性。

CD79b

CD79b仅在未成熟和成熟的B细胞中表达，在恶性肿瘤≥80%的B细胞中过表达。CD79a和CD79b是两种非共价结合的跨膜蛋白，介导信号传导和内吞作用。对于后者，CD79a-CD79b异二聚体是控制BCR内吞的支架。BCR内吞作用主要由CME完成，并由AP-2介导。有趣的是，CD79a直接与AP-2的μ亚单位相互作用，进而激活CD79b并导致整个BCR复合物的内吞。

此外，对于ADC来说，CD79a可以作为单体内化，但CD79b却不能。如果CD79b的近端膜酪氨酸（Y195）发生突变，AP-2与CD79a的结合就会被阻断，内吞也被阻断。在18%的活化B细胞样DLBCL标本中，Y195发生突变。总之，有证据表明CD79b其内吞活性依赖于整个BCR复合体的内化，而不是作为单体的内化。

TROP-2

Trop2是一种46kDa的单体糖蛋白，具有选择性过度表达、结构性内吞作用和导向溶酶体等特性，使其成为ADC的一个非常有吸引力的靶点。Trop2的内化机制与CME有关。

观察到的Trop2强大的内吞作用，一种潜在的解释可能是由于显著的Trop2聚集。研究Trop2的构象动力学，发现Trop2通过位于跨膜结构域的氨基酸“VVVVV”组成的相互作用片段形成天然的同型二聚体。Trop2的二聚作用可以通过其他细胞表面蛋白质进一步将Trop2单体招募到更接近的位置。因此，Trop2簇很可能由多个二聚体通过脂筏和其他膜结合蛋白连接而成。

Trop2与多种配体结合，如claudin-1、claudin-7、cyclin D1和IGF1，然而，这些配体都没有证明在与Trop2结合或相互作用时被内化。因此，与正常细胞相比，Trop2在肿瘤细胞中发生的内吞作用更为强烈，这些都表明Trop2是ADC的一个很好的靶点。

BCMA

BCMA或CD269，也称为TNFR超家族成员17，转导诱导B细胞存活和增殖的信号。BCMA的分子量仅为20.2 kDa，其配体结合的胞外区域具有“臂椅”构象，由六个CRD组成。除了多发性骨髓瘤外，BCMA还表达于许多血液系统恶性肿瘤，如霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。

然而，关于BCMA所利用的精确内吞途径的知之甚少。与内吞作用有关，唾液酸化是一种调节功能，它可能诱导BCMA利用CME发生内吞作用。

HER2

HER2是一种185kda跨膜糖蛋白，属于EGFR家族。HER2/neu基因的扩增是已知的人类恶性肿瘤和转移的驱动因素。由于HER2在癌症中的作用，几十年来一直被作为治疗靶点。HER2也一直是ADCs的靶点，T-DM1和T-DXT都被批准用于HER2阳性转移性乳腺癌患者。

HER2的内吞存在多种机制，首先是CME，共免疫沉淀清楚的显示HER2直接与AP-2结合，此外，dynasore能完全阻断SKBR3细胞的HER2内吞作用；其次小窝蛋白结合基序φxφxxxxφ（φ代表芳香族氨基酸Trp、Phe或Tyr）通常存在于小窝蛋白相关蛋白上，有趣的是，序列WSYGVTIW已在HER2的细胞内激酶结构域中被鉴定出；另外，有研究证明HER2可以利用CLIC/GEEC的内吞途径。

这些不同的发现揭示了HER2内吞的重要特征。首先，HER2的内吞作用是混杂的，其次，小窝介导的内吞途径似乎更常被利用。

Nectin-4

Nectin-4是一种66 kDa 的I型跨膜蛋白，其主要作用是促进细胞间的接触。Nectin-4作为ADC靶点很有吸引力，因为研究表明，它在几种肿瘤类型中过表达，但在正常成人组织中几乎不存在。

目前，没有发现天然配体或mAb/ADC与nectin-4的复合物内吞的信息，但是可以借鉴nectin-4结合病原体内吞的研究。Nectin-4也是麻疹病毒的受体，研究表明，麻疹病毒通过巨胞饮作用进入MCF7、HTB-20乳腺癌和DLD-1结直肠癌细胞。病毒进入需要PAK1，相反，dynamin抑制剂Dynasore对病毒进入没有影响。此外，表达显性负性小窝蛋白的细胞并不能消除病毒的内吞作用。

基于这些间接研究，nectin-4表现出病毒受体所需的强大的内吞活性。

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五、ADC的耐药机制

抗原表达的变化

在T-DM1的早期试验中，观察到HER2表达更高、更均匀的肿瘤更有可能对治疗产生反应。鉴于HER2可能具有相当异质性的表达，需要一致更高HER2表达的药物在HER2水平发生任何变化时都会遇到耐药性。

这一假设的进一步证据包括观察到HER2+肿瘤在治疗后表现出较低的HER2表达，并且更多的异质性表达与更高的复发率和更低的生存率相关。一项针对接受新辅助T-DM1和帕妥珠单抗治疗的早期HER2+乳腺癌患者的研究发现，治疗前存在的HER-2异质性与治疗反应呈负相关。在那些具有异质性预处理活检的患者中，没有患者获得病理学完全缓解（pCR），而55%的非异质性患者在T-DM1和帕妥珠单抗的联合作用下获得pCR。

除了异常的抗原表达水平外，抗原与另一个细胞表面受体的二聚化可能能够介导对ADC的耐药性。NRG-1β，一种已知可引发HER2/HER3异二聚化的配体，在HER2扩增的乳腺癌细胞系亚群中抑制了TDM-1的细胞毒性活性。这种耐药性可以通过添加帕妥珠单抗来克服，帕妥珠单抗是一种阻断HER2/HER3二聚化和下游信号传导的单克隆HER2抗体。TDM-1和Pertuzumab的组合在体外和体内肿瘤异种移植物研究中均显示出协同作用。

考虑到抗原异质性在介导ADC耐药性中的影响，未来解决这种耐药性的策略可能包括具有双重抗体的药物（双特异性ADC），以及增加抗原表达的联合疗法。

ADC的摄取和加工

另一种ADC耐药性的假说涉及细胞内摄取和加工的改变。ADC的复杂性，特别是与小分子相比，为出现耐药性提供了许多可能的机会。

一种提出的机制是由于一些屏障导致对细胞的渗透减少，如细胞基底膜的增加。另一个提出的机制来自最近的临床前研究，ADC确保特异性的一种机制是通过网格蛋白介导的在表达靶抗原的细胞中进行内吞摄取。在对T-DM1产生耐药性的N89-TM细胞系中，发现了另一种摄取机制，其中细胞使用小窝蛋白-1（CAV1）包被的囊泡，这可能导致效率降低。最近一项研究发现，肿瘤CAV1水平与T-DM1肿瘤摄取之间呈负相关。CAV1的遗传或药理学抑制增加了T-DM1的摄取，并在多种异种移植物模型中显示出与T-DM1的协同作用。

此外，还发现对T-DM1具有耐药的JIMT1-TM细胞系还显示包括Rab5B、ATG9a和HTT在内的蛋白质的增加，这些蛋白质介导溶酶体加工和囊泡的运输。在JIMT1-TM细胞系中，可裂解和不可裂解连接子的ADC在溶酶体中的共定位时间都比在亲本细胞中长。与亲本细胞相比，耐药性细胞系的连接子-有效载荷代谢产物都减少了。

有效载荷

一些观察到的耐药机制涉及有效载荷本身，并且可以通过使用具有替代有效载荷的ADC来克服。例如，对含有拓扑异构酶抑制剂有效载荷的ADC的耐药性可能是由拓扑异酶表达的变化或下游信号机制的变化驱动的。

在非霍奇金淋巴瘤的肿瘤模型中观察到了这一点，其中将含有auristatin有效载荷的ADC改变为含有蒽环类有效载荷的ADCs导致对治疗的响应增加。类似地，在对T-DM1具有抗性的癌细胞中，这些细胞仍然对DS-8201a（T-DXd）敏感。

由ATP结合盒转运蛋白介导的ADC有效载荷的流出增加是另一种提出的耐药机制。与亲本细胞相比，转运蛋白在对T-DM1具有抗性的细胞中的表达增加，高达20-50倍。这是gemtuzumab ozogamicin（GO）耐药性的一种机制，编码ATP结合盒的ABCB1基因水平较低的患者对GO的反应有所改善。

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六、ADC毒性的因

有效载荷

有效载荷是ADC的弹头。目前，市售ADC的有效载荷包括微管抑制剂，DNA损伤剂和拓扑异构酶抑制剂。有效载荷的性质如半数最大抑制浓度（IC50），亲水或亲脂性，电荷，药物与抗体比（DAR）和一些其他性质在ADC效率和毒性中起这关键作用。

IC50：一些具有较高的IC50值的有效载荷，如阿霉素杀伤肿瘤细胞需要比较高的浓度，ADC功效较差。最具细胞毒性的有效载荷在pg或pmol浓度甚至更低时就能够发挥细胞杀伤作用。然而，因为小于1%的ADC剂量在肿瘤部位累积，大多数剂量在身体的其余部分循环，所以即使循环中释放少量有效载荷也会产生显着的毒性。像PBD，auristatin和maytasine这些具较低IC50值的有效载荷的ADC就在多个组织/器官中表现出明显的毒性。此外，拓扑异构酶I抑制剂的IC50值介于上述两类药物之间，像trastuzumab-deruxtecan 的DAR可达到8，从而实现功效和毒性之间的平衡。

亲水性/亲脂性：亲水性有效载荷在水中具有合适的溶解度，促进药物在体内的运输和分布，并且可以很容易地与抗体偶联，从而增加DAR。另一方面，亲水性损害了ADC或其代谢物的细胞膜通透性，这使得难以发挥旁观者效应。

亲脂性有效载荷很容易通过细胞膜，但它们可能会增加ADC的聚集和免疫原性的潜力，并阻碍进入抗原识别或结合所必需的结合位点。过度的疏水性促进肝脏摄取并引起肝毒性。此外，ADC疏水性可能通过巨胞饮作用促进非特异性摄取，这可能导致眼部毒性和血小板减少。

电荷：带负电荷的有效载荷会增加ADC聚集并降低膜通透性。例如，将有效载荷从不带电的MMAE转变到带负电荷的MMAF会导致较低的ADC毒性，这可能与由于膜通透性降低而导致的旁观者效应降低有关。不带电的有效载荷增加了ADC的疏水性。当与带正电荷的抗体结合时，酸性连接子-有效载荷附着具有更大的聚集潜力。由于离子对带负电荷的细胞膜的吸引，带正电荷的分子通常会增加电荷介导的内吞作用。对于MMAF偶联的ADC，其细胞毒性受连接聚赖氨酸带正电荷的肽或带负电荷的聚谷氨酸肽的影响。

DAR：DAR与疗效和毒性呈正相关，DAR值大于9可能会增加ADC的清除率，并在肝脏中迅速积累。

除了以上这3点，一些新型有效载荷或策略可能会产生新的毒性特征。例如RNA抑制剂、Bcl-xL抑制剂、PROTAC、免疫调节剂、放射性核素（90Y，131I），有毒蛋白质（PE38），光吸收剂（IRDye700DX）和寡核苷酸等，还要双有效载荷策略。这些新型的有效载荷或策略，可能带来我们之前没遇到过的全新毒性谱，这也是未来需要重点关注的地方。

连接子

ADC中连接子的作用是将抗体连接到有效载荷，这是ADC分子稳定性和脱靶毒性的关键因素，并直接影响ADC的治疗指数。目前，连接子可分为两种类型，可裂解连接子或不可裂解连接子。

目前，ADC主流应用可裂解连接子，包括酸不稳定型，还原型和酶可裂解型。酸不稳定型，如腙连接子在血液中不稳定。gemtuzumab ozogamicin在血液循环中过早或非特异性释放有效载荷，会导致严重的骨髓抑制和肝毒性。还原型，如GSH缺乏对二硫化物还原的精确选择性以及血浆中硫醇（半胱氨酸，GSH等）的存在导致有效载荷过早释放。肽接头相对稳定，比如ValCit，它相对来说在血液中比较稳定，半衰期长。但是，ValCit对多种组织中都存在的蛋白酶比如组织蛋白酶B、K、L都比较敏感。由于只有组织蛋白酶B被认为在癌细胞中高度表达，因此对其他组织蛋白酶的广泛敏感性可能会在正常细胞中诱导脱靶毒性。相比之下，像Gly-Gly-Phe-Gly这种简单的四肽连接子，在动物实验中表现出了更好的稳定性。

不可裂解连接子优于可裂解连接子，这是由于稳定性的提高而产生的低脱靶毒性。不可裂解连接子需要溶酶体中抗体部分的蛋白水解，以在ADC被内化到细胞中后释放具有氨基酸残基和接头的有效载荷。由于有效载荷带有氨基酸残基，因此膜通透性降低，旁观者效应受到限制。

此外，连接子的属性如亲水性，长度和空间位阻对连接子的稳定性和脱靶毒性有显着影响。具有低亲水性的连接子可以将有效载荷驱动到不同的组织中，导致脱靶毒性。较短的连接子有利于有效载荷隐藏在抗体的空间结构内，从而减少有效载荷的酶促降解并延长循环中ADC的半衰期，另一方面，这可能影响ADC在靶位点的有效载荷释放。连接子的空间位阻通过阻碍暴露于连接子有效载荷附着来增加ADC的稳定性。

靶抗原

ADC的理想靶抗原要在肿瘤中高表达，在正常组织中低表达或不表达。细胞表面抗原的较高表达水平可能导致细胞内更大的有效载荷释放。即使非肿瘤组织表达较低水平的靶抗原，持续循环的大量ADC也可能导致不希望的结合和相应的不良反应。

此外，人们对肿瘤微环境中的靶标越来越感兴趣，包括新血管中的抗原，内皮下细胞外基质和肿瘤基质。预计这些更具体的靶标将进一步降低ADC的全身毒性。

抗体

抗体是ADC的重要组成部分。其亲和力，特异性，多聚反应性和Fc片段的作用直接影响ADC的功效和脱靶效应。

具有高特异性的抗体通常表现出更大的亲和力，这使得它们能够与靶抗原更紧密地结合。较高的亲和力会导致ADC更快地内化，直到达到其上限。然而，过度的亲和力产生了“结合位点屏障”，导致实体瘤中ADC分布不均匀，抗原与血管附近的细胞结合更强，对远端区域的渗透更少。抗体的亲和力还受抗体结合位点的构象，抗原，溶液的pH和温度的影响。

多聚反应性是抗体与各种自身和外来抗原结合的能力，这些抗原可能完全不相关，并且通常归因于构象更灵活的抗原结合口袋。电荷和疏水性是影响抗体多聚反应性的关键因素。此外，过量的疏水性可能导致与膜和其他疏水表面的非特异性低亲和力结合，这可能会增加胞饮速率并影响药物的PK和生物分布。

正常组织识别抗体的Fc片段可能介导非特异性内吞作用，相关受体包括Fcγ受体（FcγR），新生儿Fc受体（FcRns）和C型凝集素受体（CLR）等。例如FcγRIIa介导的巨核细胞（MK）中ADC的内化以及随后有效载荷对细胞骨架的破坏，这是血小板产生减少的潜在机制。此外，由C型凝集素家族成员甘露糖受体（MR）介导的摄取已被证明是ADC肝毒性的潜在机制。

位点偶联

ADC偶联方法分为两类，即非位点特异性偶联和位点特异性偶联。ADC已经开发了许多位点特异性偶联技术，包括涉及引入工程化反应性半胱氨酸残基，非天然氨基酸，糖基，二硫键再桥接，酶促偶联和pClick等技术。

工程化半胱氨酸残基偶联采用基因工程技术在特定位置插入半胱氨酸残基，然后将半胱氨酸上的巯基与有效载荷偶联以合成位点特异性ADC。所得产物具有高均匀性，低毒性和可调稳定性。二硫键重桥接是指打开抗体的链间二硫键以获得反应性半胱氨酸。二硫键重新桥接通常会导致较窄的DAR分布，而桥接错误是一个潜在的缺点。非天然氨基酸可以构建成重组蛋白，以获得与小分子药物发生化学反应的残留侧链，从而实现位点特异性抗体-药物偶联。然而，具有非天然氨基酸的抗体可能诱导免疫原性，非天然氨基酸的疏水性增加了抗体聚集的风险。酶促偶联和糖基偶联均可以产生高均一性和稳定性的的ADC。最近还开发了一种pClick技术，可以以更方便和有效的方式进行ADC的位点特异性偶联。

内吞作用

基于内吞作用的ADC必须内化以引起功效，但如果它们被表达靶抗原的正常组织内化，则会触发其毒性作用。正常细胞对ADC的非特异性内吞作用是毒性的重要因素。非特异性内吞作用的潜在机制主要包括小窝蛋白依赖性内吞作用、巨胞饮作用和吞噬作用。影响非特异性内吞率的关键因素是ADC的细胞类型和理化性质。带正电荷的分子被大多数细胞的细胞膜以及细胞外基质的带负电荷的基团所吸引，从而增加了非特异性内吞作用。具有高疏水性的ADC可能被其他具有高非特异性内吞能力的正常细胞迅速清除，从而导致脱靶毒性。ADC的聚集激活FcγRIIa或FcγRIIIa表达细胞，并增加FcγR依赖性非特异性摄取。

患者因素

患者的体重，年龄和医疗状况以及药物-药物相互作用在药物代谢和消除中起作用。老年人往往伴随多种基础疾病，他们的器官功能可能下降，对药物的耐受性也变差，更容易出现不良反应，甚至因为毒性太大而不得不停止治疗。基础疾病状态，比如肝肾功能不全，会显著影响药物的代谢和排泄。药物相互作用也很关键，如果患者同时服用其他药物，比如利福平或酮康唑，可能会影响Brentuximab vedotin释放的MMAE的暴露量。患者的免疫状态也会影响他们对ADC产生免疫原性的风险。所以，个体化治疗和密切监测患者的反应，对于ADC的成功应用至关重要。

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七、ADC的非临床和临床毒性

血液毒性

化疗对肿瘤最常见的副作用是骨髓抑制，因此，所有市售的ADC都有不同程度的血液毒性，表现为外周血细胞减少，如中性粒细胞减少，淋巴细胞减少和血小板减少，导致感染，出血和贫血。

不同类型的ADC的具体表现各不相同。在非临床研究中，以DNA损伤剂为有效载荷的ADC在较低剂量下显示出血液毒性，血液毒性可能与有效载荷的早期释放，连接子类型，抗体Fc片段的结构，抗原表达和非特异性内吞作用等因素有关。

胃肠道反应

13种市售ADC中有11种会引起胃肠道不良反应，包括恶心（23%–79%），呕吐（13%–47%），腹泻（2%–59%），腹痛（9%–36%），便秘（12%–37%），临床上消化不良（9.2%–12%），口干（16.7%）和口腔炎（13%–14.1%）。

为什么ADC这么容易引起胃肠道反应呢？原因可能有两个。第一，很多ADC的靶抗原，比如HER2、Trop2、Nectin4、LewisA等等，在消化系统里广泛分布。第二，人体的肠道黏膜细胞更新速度非常快，属于快速增殖细胞。而ADC的Payload通常都是超细胞毒性的，对这些快速增殖的细胞特别敏感。

所以，靶抗原的广泛表达和超细胞毒Payload的特性，共同导致了ADC频繁的胃肠道毒性。具体的机制还需要更深入的研究，理解这些因素，有助于我们未来设计出更安全的ADC。

皮肤毒性

皮肤毒性是ADC的典型AE，在非临床研究中很容易观察到，表现为皮肤色素沉着，黑斑，干燥，脱皮，脱皮，皮炎和溃疡。临床上，很少或偶尔观察到皮疹（13%–31%），瘙痒（12%–30%），皮炎（10%），干燥（4%–10%）和脱发（13%–39%）。

皮肤毒性主要是通过包含Val-Cit MMAE组件的ADC观察到的，在非临床或临床环境中表现出不同程度的皮肤毒性。此外，ADC使用SN-38，Dxd，DM4，PE38和SG3199的有效载荷也注意到非临床皮肤毒性。

周围神经疾病

周围神经疾病是ADC的典型AE，临床表现为周围感觉神经病（11%–68.2%），其特征是肌肉无力，味觉障碍，头痛，眩晕，脱髓鞘性周围神经病和周围运动神经病。使用MMAE，DM1，DM4和其他微管抑制剂治疗ADC的患者经常观察到周围神经病变。使用SN38和卡利霉素作为有效载荷的ADC治疗的患者仅报告头痛或眩晕。由于关于ADC相关外周神经毒性机制的研究很少，因此所涉及的机制尚不清楚，需要进一步研究。

眼部毒性

眼部毒性（1.2%–84%）是ADC治疗的典型AE，表现为视力障碍，干眼症，角膜病变，角膜炎，微囊上皮改变和角膜沉积物等。到目前为止，非临床毒理学研究中只有三个ADC报告了眼部毒性，人类/临床试验中的10个ADC报告了各种严重程度的眼部毒性。

已经表明眼毒性与抗原表达的可能关联。例如，针对在眼上皮中表达的MUC16的ADC的临床试验报道，40%的患者经历了眼部毒性。在组织交叉反应性研究中，Tisotumab vedotin与人类和猴子的角膜和结膜上皮组织呈阳性交叉反应，并且在非临床研究中注意到眼部毒性。临床上报道了高频率的不良眼部反应，包括3.2%的患者出现严重的溃疡性角膜炎。

肝毒性

肝毒性是ADC的常见AE。13个ADC中有9个在非临床研究中报告了肝毒性，主要表现为肝氨基转移酶升高和肝脏组织病理学改变。临床上，在13个ADC中有10个注意到肝氨基转移酶升高（24%–98%）。

在非临床研究中，具有MMAE有效载荷的ADC几乎总是表现出肝毒性。由于单独使用MMAE可能在较低剂量下引起肝损伤，因此认为相关的ADC肝毒性与循环中MMAE暴露有关。另一方面，HER2，EGFR，TF和CD30的靶抗原都在肝脏中表达，并且在非临床研究中注意到相关的ADC具有肝毒性。总之，ADC的肝毒性与有效载荷，靶抗原表达，Fc受体和非特异性内吞作用有关。

肺毒性

间质性肺炎（ILD）是一组以肺损伤为特征的疾病，以不同程度的炎症和间质纤维化为特征的异质性弥漫性实质性肺病。ILD是药物相关肺毒性的最典型形式，在大多数情况下是由抗肿瘤药物诱导的，这些药物通常可以通过细胞毒性和免疫作用机制引起ILD。

其他

除了上述毒性外，还报道了人类 ADC 的其他 AE 。例如，已经观察到多种 ADC 的生殖毒性；用 polatuzumab vedotin ， sacituzumab govitecan 和 moxetumomab pasudotox 观察到肾功能损害；用 T-DM1 ， gemtuzumab ozogamicin 和 loncastuximab tesirine 观察到心血管不良事件；用 moxetumomab pasudotox 观察到毛细血管渗漏综合征和溶血性尿毒症综合征；在临床试验中观察到单个 ADC 的质膜毒性。

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结语

自第一个ADC获得批准以来，二十多年来，人们不断努力以各种方式优化ADC成分，例如，改变现有的有效载荷，探索对切割具有更强特异性的连接子和更合适的稳定性，通过最新的偶联和掩蔽技术优化抗体结构，寻找具有更高特异性的靶抗原，以及探索新型ADC，包括非内吞ADC和XDC。所有这些努力都希望有效降低脱靶毒性，提高患者对ADC的耐受性。

作为当今最有前景的药物类别之一，尽管目前ADC的发展仍面临许多挑战，但随着新兴技术创新和资本市场的持续投入，具有更高疗效和更高安全维度的ADC正在不断被开发出来应用于治疗癌症和其它疾病，造福广大患者。

参考资料：

1.The Chemistry Behind ADCs. Pharmaceuticals (Basel). 2021 May; 14(5): 442.

2.Overview of antibody-drug conjugates nonclinical and clinical toxicities and related contributing factors. Antib Ther. 2025 Mar 18;8(2):124–144

3.Mechanisms of Resistance to Antibody-Drug Conjugates. Cancers (Basel).2023 Feb 17;15(4):1278

4. Impact of EndocytosisMechanisms for the Receptors Targeted by the Currently Approved Antibody-DrugConjugates (ADCs)—A Necessity for Future ADC Research and Development. Pharmaceuticals(Basel). 2021 Jul; 14(7): 674.

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